2 Малышев И.Ю. 1, 2

1 ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Москва

2 УРАМН НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва

Значимую роль в инициации и развитии воспалительных реакций в легких играют альвеолярные макрофаги – одни из центральных клеток системы врожденного иммунитета. Важными компонентами врожденного ответа являются способность макрофагов к фагоцитированию и их миграционная активность. Альвеолярные макрофаги провоспалительного М1 фенотипа, выделенные от мышей линии С57/BL6, обладают большей фагоцитарной активностью по отношению к S.aureus по сравнению с выделенными от мышей линии BALB/c альвеолярными макрофагами антивоспалительного М2 фенотипа. При сравнительном анализе миграционной активности установлена альтернативная зависимость показателя активности от типа используемого хемоаттрактанта.

макрофаги

фенотипы макрофагов

фагоцитоз

миграционная активность

1. Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling / S.F. Badylak, J.E. Valentin, A.K. Ravindra et al. // Tissue Eng Part A. – 2008. – Vol. 14. Issue 11. – P. 1835–42.

2. Benoit M., Desnues B., Mege J.L. Macrophage Polarization in Bacterial Infections // The Journal of Immunology. – 2008. – Vol. 181. – P. 3733–3739.

3. Cairo G., Locati M., Mantovani A. Control of iron homeostasis as a key component of macrophage polarization // Haematologica. – 2010. – Vol 95, Issue 11. – P. 1801–1803.

4. Pulmonary Immunobiology and Inflammation in Pulmonary Diseases. NHLBI Workshop Summary / D. Crapo, A.G. Harmsen, M.P. Sherman, R.A. Musson // Am J Respir Crit Care Med. – 2000. – Vol. 162. – P. 1983–1986.

5. Frevert, Wong, Goodman et al. Rapid Fluorescence-based Measurement of Neutrophil Migration in Vitro // Journal of Immunological Methods. – 1998. – Vol. 213. – P. 41–52.

6. Goldmann O., von Köckritz-Blickwede M., Höltje C. et al. Transcriptome Analysis of Murine Macrophages in Response to Infection with Streptococcus pyogenes Reveals an Unusual Activation Program // Infect Immun. – 2007. – Vol. 75, Issue 8. – P. 4148–57.

7. Lasbury, M.E., Durant P.J., Lee C.H.. Numbers of alveolar macrophages are increased during Pneumocystis pneumonia in mice // J. Eukaryot. Microbiol. – 2003. – Vol. 50(Suppl). – P. 637–638.

8. Lay J.C., Alexis N.E., Zeman K.L., et al. In-vivo Uptake of Inhaled Particles by Airway Phagocytes is Enhanced in Mild Asthmatics Compared to Normal Volunteers // Thorax. – 2009. – Vol. 64. – P. 313–320.

9. Martinez F.O., Sica A., Mantovani A. et al. Macrophage activation and polarization // Front Biosci. – 2008. – Vol. 13. – P. 453–61.

10. Platt N., Haworth R., da Silva R.P., Gordon S. Scavenger receptors and phagocytosis of bacteria and apoptotic cells // Advances in Cellular and Molecular Biology of Membranes and Organelles. – 1999. – Vol. 5. – P. 71–85.

11. Stangel M., Joly E., Scolding N.J., Compston D.A.S. Normal polyclonal immunoglobulins (‘IVIg’) inhibit microglial phagocytosis in vitro // Journal of Neuroimmunology. – 2000. – Vol. 106(1). – P. 137–144

12. Tumitan A.R., Monnazzi L.G., Ghiraldi F.R. et al. Pattern of macrophage activation in yersinia-resistant and yersinia-susceptible strains of mice // Microbiol Immunol. – 2007. – Vol. 51(10). – P. 1021–8.

Воспалительные реакции играют исключительно важную роль в развитии большого количества заболеваний легких, таких как бронхиальная астма, острый респираторный дисстресс синдром и бронхолегочная дисплазия . Известно, что одну из центральных ролей в инициации и развитии воспалительных реакций в легких играют альвеолярные макрофаги. При активации эти клетки продуцируют свободные радикалы, NO, цитокины, кемокины и другие медиаторы воспаления и благодаря этому запускают врожденный и адаптивный иммунный ответ и обезвреживают патогенные микробы.

В ходе иммунного ответа нативные макрофаги могут приобретать различные функциональные фенотипы . Так, классический М1 фенотип характеризуется продукцией провоспалительных цитокинов и кемокинов, таких как TNF-α, IL-1ß, IL-6, IL-12, воспалительного белка макрофагов 1α (MIP-1α), а также повышенной генерацией оксида азота (NO) . М1 макрофаги являются эффекторными клетками, которые интегрированы в Th1 ответ. Этот фенотип убивает микроорганизмы и опухолевые клетки и продуцирует большие количества провоспалительных цитокинов . Альтернативный М2 фенотип макрофагов характеризуется продукцией антивоспалительных цитокинов, таких как IL-10 и рецептор-ловушки IL-1 (IL-1ra). Функциональное предназначение М2 фенотипа состоит прежде всего в регулировании воспалительного ответа, участии в ангиогенезе, ремоделировании тканей и восстановлении иммунного гомеостаза, нарушенного воспалением.

Очевидно, что эффективность, с которой врожденный иммунитет будет удалять патогенные микробы и при необходимости стимулировать ангиогенез, ремоделирование и восстановление поврежденных тканей, существенно зависит от фагоцитарной активности макрофагов, и от того, как быстро эти клетки могут приходить в очаг воспаления, т.е. от их миграционной активности.

Таким образом, способность к фагоцитированию и миграционная активность макрофагов составляют важные компоненты врожденного ответа, от которого зависит, как быстро иммунная система сможет восстановить гомеостаз, нарушенный появлением инфекции и повреждением тканей. Однако до сих пор важный вопрос о том, каковы различия фагоцитарной способности и миграционной активности М1 и М2 фенотипов макрофагов остается открытым.

Цель данной работы состояла в том, чтобы ответить на этот вопрос.

Материалы и методы исследования

Мыши

Для изучения функциональных ответов (определения фагоцитарной и миграционной активности) выделение альвеолярных макрофагов проводилось у мышей различных линий. Известно, что разные генетические линии животных могут иметь разные фенотипы макрофагов. Например, мыши линии С57/BL6 имеют М1 фенотип, тогда как мыши Balb/c - М2 фенотип . Мыши линий С57/BL6 и Balb/c были получены из вивария ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России, Москва, Россия. Для исследований использовались самцы обеих линий, возраст 10-12 недель, массой 23-28 г. Исследования проводились в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики (GLP). Мыши содержались в условиях вивария, не допускающих попадание патогенных микроорганизмов.

Выделение альвеолярных макрофагов

Альвеолярные макрофаги выделялись из бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) мышей. Предварительно мышам внутрибрюшинно вводился раствор хлоралгидрата (из расчета 32,5 нг на 100 г веса животного), впоследствии мыши умерщвлялись с помощью перерезания нижней полой вены и обескровливания. Для получения бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ) в легкие через внутритрахеальный катетер вводилось по 1 мл стерильного фосфатного буфера PBS 37 °С (у каждого животного выполнялось по 4 промывки) . Полученный БАЛ центрифугировался при 1000 об./мин 4 мин. Клеточный осадок ресуспендировали в 3 мл среды RPMI 1640 с последующим определением количества макрофагов в камере Горяева и доведением концентрации клеток в среде RPMI 1640 до 1∙106/мл.

Определение фагоцитарной активности альвеолярных макрофагов

Определение фагоцитарной активности макрофагов производилось на взвеси клеток, полученных из бронхо-альвеолярного лаважа по методике, указанной выше. В качестве объекта фагоцитоза использовали инактивированный нагреванием штамм Staphylococcus aureus 9198. Бактериальную взвесь готовили из суточной культуры убитых прогреванием при температуре 56 °С в течение 1 часа микроорганизмов с последующей трехкратной отмывкой в стерильном физиологическом растворе. По стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85П 10 единиц (ГИСК им. Л.А. Тарасевича) определяли концентрацию бактериальных клеток, доводя до 1∙10 9 /мл. В промаркированные лунки 24-луночного планшета вносили макрофаги в среде RPMI 1640 с концентрацией 1∙10 6 /мл и Staphylococcus aureus 9198 (концентрация микроорганизмов у подготовленного штамма составляет 1∙10 9 /мл) в соотношении макрофаги/стафилококк - 1:400; 1:600; 1:800; 1:1000) до общего объема 1 мл/лунка. Планшет с макрофагами и микроорганизмами инкубировали в течение 3 часов при температуре 37 ± 0,5 °С при 5 % СО 2 . Через 3 часа лунки планшета промывались раствором Хенкса (+ 4 °С), высушивались при комнатной температуре в течение 30 минут с последующей фиксацией абсолютным этиловым спиртом и краской по Романовскому-Гимзе. Фагоцитарная функция макрофагов оценивалась прямым визуальным подсчетом поглощенных микробов. При использовании прямого визуального метода рассчитывался фагоцитарный индекс (ФИ) - процент фагоцитирующих клеток от общего числа и фагоцитарное число (ФЧ) - среднее количество микробов, захваченных одной клеткой (оценивалось только для фагоцитирующих клеток).

Определение миграционной активности макрофагов

Определение миграционной активности макрофагов производилось на взвеси клеток, полученных из бронхо-альвеолярного лаважа по методике, указанной выше, ресуспендированных в хемотаксической среде (RPMI без фенолового красного 96 мл, 1М HEPES - 1 мл, 7,5 % NaHCO3 - 2 мл, 200 mM L-глутамин - 1 мл, BSA - 0,5 г).

В основе методики определения миграционной активности альвеолярных макрофагов лежит принцип метода Бойдена, основанный на прохождении лейкоцитов из одной половины камеры с взвесью клеток в другую половину камеры, содержащую хемоатрактант, и разделенных между собой мембранным фильтром. Анализ хемотаксиса проводился непосредственно по методике Neuro Probe Protocol .

В нижние промаркированные микроячейки камеры вносили по 30 мкл хемоаттрактанта (использовали БАЛ мышей линии С57/BL6 и Balb/c), помещали фильтр с диаметром пор 8 мкм, камеру закрывали и в верхние микроячейки камеры вносили по 100 мкл суспензии клеток (с концентрацией 1∙106/мл) в хемотаксической среде. Заполненную камеру инкубировали в течение 3 часов при температуре 37 ± 0,5 °С при 5 % СО2. Через 3 часа из верхних ячеек камеры проводилась аспирация клеток, ячейки заполнялись 2 мМ ЭДТА в 1∙PBS на 15 минут с последующей аспирацией ЭДТА. Камеру открывали и клетки с верхней стороны мембраны удаляли с помощью Q-наконечника. Затем мембрану центрифугировали при 1500 g 15 минут (при +4 °С). Окрашивание мембраны проводили азур-эозином по Романовскому в течение 15 минут. Подсчет количества мигрировавших клеток проводился в каждой ячейке под оптическим микроскопом.

Для оценки миграционной активности нами был использован индекс миграции - отношение количества мигрировавших клеток к количеству немигрировавших в одной лунке.

Результаты исследования и их обсуждение

На рисунке представлены данные о фагоцитарной активности макрофагов двух фенотипов в зависимости от соотношения количества бактерий на один макрофаг.

Сравнительная оценка фагоцитарной активности макрофагов М1 фенотипа, выделенных
из мышей линии С57 и макрофагов М2 фенотипа, выделенных из мышей линии BABL/c

Видно, что при всех соотношениях среднее количество бактерий, поглощенных одним М1 макрофагом, было достоверно больше, чем у М2 макрофагов. Это означает, что М1 фенотип более эффективно фагоцитирует S.аureus, чем М2 фенотип. При этом фагоцитарная активность М1 фенотипа больше зависела от концентрации S. Aureus, чем у М2 фенотипа. На графике это отражается в более крутом подъеме кривой М1, по сравнению с М2.

Дальше в таблице представлены данные о миграционной подвижности макрофагов М1 и М2 фенотипов в ответ на два разных типа хемоаттрактантов: БАЛ, выделенный из мышей линии BALB/c (БАЛ BALB/c), и БАЛ из С57 (БАЛ С57).

Сравнительная оценка миграционной активности макрофагов М1 фенотипа, выделенных из мышей линии С57, и макрофагов М2 фенотипа, выделенных из мышей линии BABL/c. Миграционная активность количественно оценивалась по миграционному индексу, представленному как соотношение количества мигрировавших клеток к немигрировавшим

Эти данные позволяют сделать несколько важных выводов.

Во-первых, сравнительная оценка миграционной подвижности М1 и М2 фенотипов альтернативно отличается в зависимости от того какой тип хемоаттрактанта-БАЛ был использован. Действительно, в случае, когда в качестве хемоаттрактанта используется БАЛ BALB/c , активность макрофагов М2 существенно выше, по сравнению с М1 (1,88 ± 0,13 vs 1,12 ± 0,12, р < 0,01). В том же случае, когда в качестве хемоаттрактанта используется БАЛ С57 , активность макрофагов М1 существенно выше, по сравнению с М2 (1,50+0,11 vs 0,93 ± 0,12, р < 0,01).

Во-вторых, миграционная активность М2 макрофагов, выделенных из мышей BALB/c в ответ на «родной» БАЛ BALB/c , достоверно выше, чем активность М1 макрофагов, выделенных из мышей С57 в ответ на свой «родной» БАЛ С57 (1,88 ± 0,13 vs 1,50 ± 0,11, р < 0,05).

В-третьих, миграционное движение макрофагов на собственный «родной» БАЛ существенно выше, чем на «чужеродный» БАЛ. Так, миграционная активность макрофагов М2 фенотипа, выделенных из мышей BALB/c в ответ на свой БАЛBALB/c, была в два раза выше, чем на чужеродный БАЛС57 (1,88 ± 0,13 vs 0,93 ± 0,12, р < 0,001). Аналогичным образом, миграционная активность макрофагов М1 фенотипа, выделенных из мышей С57 в ответ на свой БАЛС57, была почти в полтора раза выше, чем на чужеродный БАЛBALB/c (1,50 ± 0,11 vs 1,12 ± 0,12, р < 0,05).

Результат того, что макрофаги М1 фенотипа, выделенные от мышей С57, обладают большей фагоцитарной активностью по отношению к S.aureus, по сравнению с макрофагами М2 фенотипом, выделенными от мышей BALB/c, является вполне предсказуемым. Вероятно, в значительной степени это связано с тем, что М1 макрофаги иммунологически «ориентированы» на захват внутриклеточных микробов, таких как бактерии и вирусы , и они, по сравнению с М2 фенотипом, имеют большее представительство микробных паттерн-распознающих рецепторов фагоцитоза .

М2 фенотип участвует в ремоделировании и восстановлении поврежденных тканей , поэтому больше «ориентирован» на захват мертвых фрагментов погибших клеток или инородных неживых части-
чек . Поэтому не исключено, что при использовании вместо S.aureus, например, частичек краски или латексных шариков, фагоцитоз М2 фенотипа будет более эффективен по сравнению с М1. Подтверждение этому действительно есть в литературе. Так показано, что по отношению к латексным шарикам и частицам зимозана фагоцитоз М2 фенотипа был более эффективен, по сравнению с М1 фенотипом .

Таким образом, сравнительный вывод о фагоцитарной активности разных фенотипов макрофагов должен всегда учитывать природу фагоцитируемого агента: бактерии, частички краски, или мертвые фрагменты клеток. В нашем случае, в отношении S.aureus фагоцитарная активность М1 фенотипа была существенно выше, по сравнению с М2 фенотипом макрофагов.

При сравнительном анализе миграционной активности складывается аналогичная ситуация, а именно, наши данные показали, что сравнительная оценка альтернативно зависит от типа используемого хемоаттрактанта. Очевидно, что выяснение причин такой зависимости потребует подробной расшифровки состава хемоаттрактантных молекул в двух типах БАЛ и ответ на вопрос, каковы отличия между БАЛBALB/c и БАЛС57 по содержанию хемоаттрактантных кемокинов, цитокинов, сурфактантных белков и др.

Очевидно, что в наших условиях, миграционная активность макрофагов зависела от двух факторов:

1) собственная способность макрофага того или иного фенотипа к движению;

2) концентрация и мощность хемоаттрактантных молекул в том или ином БАЛ.

Поэтому при сравнительной оценке миграционной активности разных фенотипов макрофагов, выделенных из разных линий животных, целесообразно использовать интегральный подход, то есть оценивать миграционную активность макрофагов в своих естественных условиях своего БАЛ. При таком подходе оказалось, что миграционная активность М2 макрофагов мышей BALB/c оказалась достоверно выше таковой для М1 макрофагов мышей С57.

И, наконец, также заслуживает внимания еще один интересный факт, что миграционная активность и М1, и М2 фенотипов существенно снижалась в ответ на чужеродный БАЛ. Это кажется странным, потому что макрофаг есть именно та клетка иммунной системы, которую «чужеродное» должно привлекать гораздо сильнее, чем «свое». Для ответа на этот вопрос также необходимо проанализировать химический и молекулярный состав БАЛ мышей разных линий.

В целом наши результаты показали, что фагоцитарная и миграционная активность М1 и М2 фенотипов макрофагов существенно различается, однако вывод о направленности этих различий необходимо делать с учетом конкретных условий проявления этих активностей.

Рецензенты:

Чеснокова Н.П., д.м.н., профессор, профессор кафедры патологической физиологии ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения и социального развития РФ, г. Саратов;

Архипенко Ю.В., д.б.н., профессор, зав. лабораторией адаптационной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, г. Москва.

Работа поступила в редакцию 10.11.2011.

Библиографическая ссылка

Лямина С.В., Веденикин Т.Ю., Круглов С.В., Шимшелашвили Ш.Л., Буданова О.П., Малышев И.Ю., Малышев И.Ю. ОСОБЕННОСТИ ФАГОЦИТАРНОЙ И МИГРАЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ АЛЬВЕОЛЯРНЫХ МАКРОФАГОВ М1 И М2 ФЕНОТИПОВ // Фундаментальные исследования. – 2011. – № 11-3. – С. 536-539;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=29267 (дата обращения: 13.12.2019). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»

Макрофаги – это клетки, которые играют ключевую роль в воспалении. Новые исследования – под руководством Тринити-колледжа в Дублине в Ирландии – обнаружили ранее неизвестный процесс, который может отключить синтез воспалительных факторов в макрофагах.

Ученые предполагают, что новое открытие улучшит наше понимание воспаления и инфекции.

Они надеются, что это приведет к новым методам лечения воспалительных патологий, таких как сердечные заболевания, ревматоидный артрит и воспалительные заболевания кишечника.

Их недавнее открытие относится к молекуле, известной как итаконат , которую макрофаги производят из глюкозы. Предыдущие исследования уже показали, что итаконат помогает регулировать функцию макрофагов, но механизмы в то время были неизвестны.

Давно известно, что макрофаги вызывают воспаление, но только что мы обнаружили, что их можно “остановить” при помощи итаконата.

Используя человеческие клетки и мышиные модели, Luke O’Neill и его коллеги обнаружили, что производство итаконата было похоже на активацию “выключенного переключателя” на макрофаге, которая приводила к снижению воспаления.

Исследователи сообщают о своих выводах в статье, опубликованной в журнале Nature .

Воспаление и макрофаги

Воспаление – это серия биохимических реакций, запускаемых иммунной системой, когда она обнаруживает то, что может нанести вред нашему организму. Мы можем видеть и чувствовать воспаление, когда, например, пораним палец: область раны набухает, краснеет, прореживается и становится болезненной.

По мере развития процесса воспаления группы разных клеток выделяют вещества, которые, в свою очередь, вызывают ряд реакций. Например, они заставляют кровеносные сосуды расширяться и становиться проницаемыми, так что большее количество клеток крови может достигать места повреждения. При этом происходит раздражение нервных окончаний, чтобы сообщения о боли транслировались в мозг.

Однако эта мощная система защиты также может срабатывать, когда иммунитет ошибочно атакует здоровые клетки и ткани (явление, известное как аутоагрессия иммунной системы ). Это приводит к хроническим воспалительным заболеваниям, которые могут длиться много лет, а иногда даже всю жизнь.

Макрофаги представляют собой разнообразные клетки, которые участвуют во многих важных процессах в организме, включая воспаление.

Итаконат и интерфероны типа I (ИФН I)

Как и многие клетки, макрофаги в качестве энергии используют глюкозу. Однако, они также могут использовать глюкозу для производства итаконата. Ученые знали, что итаконат помогает регулировать многие клеточные процессы в макрофагах, но связанная с этим биохимия была неясна.

В новом исследовании профессор Luke O’Neill со своей командой впервые показали, что итаконат необходим для активации противовоспалительного фактора транскрипции в макрофагах мыши и человека.

Nrf2 – это белок в организме млекопитающего, который играет решающую роль в восстановлении поврежденных тканей и препятствует возникновению злокачественных новообразований. Обнаруживая проблему, белок Nrf2 может активировать до двухсот генов, с помощью которых будет произведен “ремонт” клетки.

Ученые продемонстрировали, как, изменяя производство нескольких воспалительных белков, итаконат защищал мышей от смертельного воспаления, которое может возникнуть во время инфекции.

Одним из эффектов производства итаконата было ограничение воспалительной реакции, включающей интерфероны I типа.

Интерфероны I типа (ИФН I) представляют собой группу белков, которые влияют на иммунные реакции, возникающие при заражении вирусами, бактериями, грибами и другими патогенами.

Известно, что белки особенно важны для защиты от вирусов. Однако они могут также вызывать нежелательные реакции при некоторых типах инфекций.

Итаконат является критическим противовоспалительным метаболитом, который действует через Nrf2, чтобы ограничить воспаление и модулировать интерфероны I типа.

Будучи первым, кто описывает химические реакции, связанные с противовоспалительными эффектами итаконата, исследование представляет собой новаторскую работу в области изучения воспаления.

Теперь ученые планируют выяснить, как использовать полученные результаты для создания новых противовоспалительных препаратов.

Мы надеемся, что наша работа сможет помочь многим людям с аутоиммунными заболевания.

В дополнение к исследователям из Тринити-колледжа в Дублине, участие в работе принимали ученые из Гарвардской медицинской школе в Бостоне, Университета Джонса Хопкинса в Балтиморе, Университета Кембриджа, Оксфордского университета, Университета Данди и фармацевтической компании GlaxoSmithKline.

Нейтрофилы (полиморфноядерныe лейкоциты, ПЯЛ)

Это подвижные фагоциты с сегментированным ядром. Нейтрофилы идентифицируют либо по структуре ядра, либо по поверхностному антигену CD66.

Основную роль в эффекторных функциях нейтрофилов играют компоненты гранул. Гранулы нейтрофилов классифицируют на первичные, вторичные, третичные и секреторные пузырьки. Различия между классами гранул могут быть определены после анализа белков-маркеров. В гранулах нейтрофилов сохраняется около 300 различных белков, которые могут быть освобождены в окружение клетки или оставаться присоединенными к мембране нейтрофилов.

Секреторные пузырьки
Считают, что секреторные пузырьки формируются только в зрелых сегментоядерных нейтрофилах при поступлении их в кровоток . Секреторные пузырьки по происхождению эндосомы , и представляют собой пул рецепторов, включаемых в плазматическую мембрану после слияния мембраны секреторных пузырьков с мембраной нейтрофила. В мембране секреторных пузырьков множество рецепторов - β2-интегрины, Cr1, рецепторы формил-пептида (fpr), CD14, CD16, а также ферменты металлопротеиназы и щелочная фосфатаза. В полости секреторных пузырьков содержится альбумин и белок, связывающий гепарин (HBP). Маркерный фермент пузырьков - щелочная фосфатаза.

Вторичные и третичные гранулы
Пероксидазонегативние гранулы нейтрофилов могут быть разделены на вторичные и третичные, которые отличаются содержанием белков и секреторными свойствами. Вторичные гранулы содержат больше антибактериальных соединений, чем третичные. Третичные гранулы легче, чем вторичные подвергаются экзоцитозу. Третичные гранулы – резерв матрикс-деградирующих ферментов и мембранных рецепторов, необходимых для экстравазации и диапедеза нейтрофила . Напротив, вторичные гранулы участвуют главным образом, в антибактериальных действиях нейтрофилов путем мобилизации в фагосомы или секрецию во внешнюю среду. В арсенале их антибактериальных пептидов - лактоферрин, NGAL, лизоцим и hCAP18, LL-37. Маркерный белок третичных гранул - фермент желатиназа, вторичных – лактоферрин .

Первичные гранулы
Первичные гранулы содержат кислые гидролазами, в том числе кислую фосфатазу и антибактериальные белки; их мембрана лишена рецепторов. У человека антибактериальные белки представлены нейтрофильными пептидами – α-дефензинами и сериновыми протеазами с антибактериальной активностью. При созревании нейтрофилов в костном мозге первыми еще на стадии миелобластов формируются азурофильные гранулы; дефензины (катионные белки) в азурофильных гранулах синтезируются на второй стадии дифференцировки нейтрофилов - стадии образования промиелоцитов.

Маркерный белок этих гранул фермент миелопероксидазы.

Моноциты/макрофаги

Моноциты – это фагоциты, которые циркулируют в крови. Когда моноциты мигрируют в ткани, они превращаются в макрофаги. Моноциты имеют характерную форму ядра в виде почки. Они могут быть определены морфологически или по CD14 – маркеру клеточной поверхности. В отличие от ПЯЛ они не содержат гранул, но имеют многочисленные лизосомы, содержимое которых похоже на содержимое гранул нейтрофилов. Специализированные виды макрофагов могут быть найдены во многих органах, включая легкие, почки, мозг и печень.

Макрофаги выполняют множество функций. Как мусорщики, они удаляют из организма изношенные клетки, иммунные комплексы. Макрофаги представляют чужеродный антиген для распознавания его лимфоцитами, в этом отношении макрофаги похожи на дендритные клетки. Макрофаги способны секретировать удивительное разнообразие мощных химических сигналов – монокинов, которые жизненно важны для иммунного ответа неспецифического иммунитета: ответ фагоцитов на инфекцию.

Циркулирующие в крови нейтрофилы и моноциты реагируют на сигналы опасности (SOS), образующиеся в месте локализации инфекции. SOS сигналы включают в себя N-формил-метионин, освобождаемый бактериями; пептиды, образующиеся при свертывании крови, растворимые пептиды – продукты активации системы комплемента и цитокины, секретируемые тканевыми макрофагами, которые столкнулись в тканях с бактериями. Некоторые из сигналов SOS стимулируют экспрессию молекул клеточной адгезии на эндотелиальных клетках неподалеку от места инфекции, такие как ICAM-1 и селектины. Молекулы адгезии связываются с комплементарными структурами на поверхности фагоцитирующих клеток. Как следствие нейтрофилы и моноциты прилипают к эндотелию. Вазодилататоры, освобождаемые в месте инфекции тучными клетками, способствуют диапедезу прилипших фагоцитов через эндотелиальный барьер " и миграции их к месту локализации инфекции. Перемещение в тканях по градиенту концентрации молекул SOS. Параллельно SOS сигналы активируют фагоциты, что приводит к усилению, как поглощения возбудителей, так и внутриклеточному уничтожению инвазивных организмов.

Инициирование фагоцитоза при неспецифическом иммунитете

Клетка- фагоциты имеет на своей мембране рецепторы, способствующие связыванию их с возбудителем-антигеном, и поглощать его. К важнейшим рецепторам относятся следующие структуры.

1. Fc-рецепторы - если с бактериями связываются антитела IgG , то на поверхности бактерий будут Fc-фрагменты, которые распознаются и связываются Fc- рецептором на фагоцитах. На поверхности одного нейтрофила содержится порядка 150 000 таких рецепторов! Связывание бактерий, покрытых IgG, инициирует фагоцитоз и активацию метаболической активности фагоцитов (респираторный взрыв).

2. Рецепторы комплемента - фагоциты имеют рецепторы для С3b компонента комплемента, При активации комплемента при взаимодействии со структурами поверхности бактерий, последняя покрывается гидрофобным фрагментом C3b. Связывание рецептора к C3b с С3b на приводит также к повышению фагоцитоза и стимулированию респираторного взрыва.

3. Рецепторы - мусорщики связывают широкий спектр полианионов на бактериальной поверхности, опосредуя фагоцитоз бактерий.

4. Toll-подобные рецепторы - фагоциты имеют различные Toll-подобные рецепторы, которые признают широкий спектр консервативных структур на поверхности инфекционных агентов. Связывание инфекционных агентов через Toll-подобных рецепторов приводит к фагоцитозу и высвобождению провоспалительных цитокинов (IL-1, TNF-альфа и IL-6) фагоцитами.

Фагоцитоз и неспецифический иммунитет

После прикрепления бактерий, мембрана фагоцитов образует псевдоподии, которые, в конце концов, окружают бактерию и поглощают её, бактерии оказывается заключенной в фагосому. Фагосомы сливаются с вторичными гранулами, образуя фаголизосому.

Респираторный взрыв и внутриклеточный киллинг при неспецифическом иммунитете

Во время фагоцитоза, фагоцитирующие клетки увеличивают потребление глюкозы и кислорода, этот процесс называют респираторный взрыв. Следствие респираторного взрыва – образование активных форм кислорода, которые способны убить бактерии в составе фаголизосомы. Этот процесс называют кислород-зависимый внутриклеточный киллинг. Кроме того, в составе фаголизосомы бактерии и могут быть уничтожены под действием уже имеющегося содержимого в гранулах. Комплекс этих реакций называют кислород независимый внутриклеточный киллинг.

1. В процессе фагоцитоза включается механизм прямого окисления глюкозо-6-фосфата в пентозофосфатном пути с образованием НАДФН. Тотчас осуществляется сборка надмолекулярного комплекса активной молекулы НАДФН-оксидазы. Активированная НАДФН-оксидаза использует кислород для окисления НАДФН. В результате реакции образуется супероксид-анион. Под действием супероксиддисмутазы часть супероксид-анионов превращается в синглетный кислород и H 2 O 2 Другая часть супероксид-анионов взаимодействует с Н 2 О 2 с образованием гидроксильных радикалов и синглетного кислорода. В результате всех этих реакций образуются токсичные кислорода соединений супероксид-анион перекись водорода, синглетный кислород и гидроксильные радикалы (ОН ).

2. Кислород зависимый миелопероксидаза-зависимый внутриклеточный киллинг

Как только азурофильные гранулы сливаются с фагосомой, в состав фаголизосомы высвобождается миелопероксидаза. Миелопероксидаза катализирует реакцию образования гипохлорит иона из H2O2 и хлорид иона. Гипохлорит иона высокотоксичное соединение, мощный окислитель. Некоторая часть гипохлорита может самопроизвольно распадаться до синглетного кислорода. В результате этих реакций образуются токсичные гипохлорит (OCl -) и синглетный кислород (1 O2).

3. Реакции детоксикации (табл. 3)

Нейтрофилы и макрофаги располагают средствами защиты от действия активных форм кислорода. Эти реакции включают дисмутацию супероксид аниона в перекись водорода супероксиддисмутазой и конверсию перекиси водорода в воду каталазой.

4. Кислород-независимый внутриклеточный киллинг

Кислород-независмые механизмы внутриклеточного киллинга

5. Зависимый от оксида азота киллинг в реакциях неспецифического иммунитета

Связывание бактерий макрофагами, в частности, посредством Toll-подобных рецепторов, приводит к продукции ФНО-альфа, который аутокринно (стимулирует те же клетки, которые его секретировали) индуцирует экспрессию гена индуцибельной NO синтазы (iNOS), в результате чего макрофаги синтезируют оксида азота (NO). Если клетка подвергается действию гамма-интерферона (IFN-гамма) , синтез оксида азота усиливается. Концентрация оксид а азота, освобождаемого макрофагами, обладает выраженным токсическим действием на микроорганизмы в непосредственной близости от макрофагов.

Глава 3. Моноциты и макрофаги

Моноциты и макрофаги являются основными клетками системы фагоцитирующих мононуклеаров (ВОЗ) или макрофагальной системы И. И. Мечникова.

Моноциты берут начало от гранулоцитарно-моноцитарной клетки-предшественницы, макрофаги – от моноцитов, переходящих из кровяного русла в ткани. Макрофаги присутствуют во всевозможных тканях человеческого организма: в костном мозге, в соединительной ткани, в легких (альвеолярные макрофаги), в печени (купферовские клетки), в селезенке и лимфатических узлах, в серозных полостях (брюшной полости, полости плевры, полости перикарда), в костной ткани (остеокласты), в нервной ткани (микроглиальные клетки), в коже (клетки Лангерганса). Они могут быть как свободными, так и фиксированными. Кроме того, к макрофагальным элементам относятся и дендритические клетки (имеющие большое количество коротких ветвящихся отростков), присутствующие во всех тканях. При проведении многочисленных операций по трансплантации костного мозга от донора иного пола было доказано кроветворное происхождение альвеолярных макрофагов, купферовских клеток, клеток Лангерганса и остеокластов.

Сформировавшись в костном мозге, моноцит находится там от 30 до 60 ч. После этого он делится и поступает в системный кровоток. Период циркуляции моноцита в крови составляет приблизительно 72 ч, где происходит его созревание. Ядро моноцита трансформируется из круглого сначала в бобовидное, а затем в лапчатое. Помимо этого, отмечается изменение структуры генетического материала клетки. Цвет цитоплазмы моноцита может быть совершенно различным – от базофильного до серо-голубого или даже розоватого. После выхода из кровяного русла моноцит больше не может вернуться в системную циркуляцию.

Макрофаги, расположенные в различных тканях человеческого организма, имеют ряд общих особенностей. При исследовании альвеолярных макрофагов было выявлено, что тканевые макрофаги поддерживают свою популяцию не только за счет образования в костном мозге, но также за счет имеющейся у них способности к делению и самоподдержанию. Данная отличительная черта макрофагов становится очевидной в случае подавления образования данных клеток крови в костном мозге под влиянием облучения или препаратов с цитостатическим действием.

Ядро макрофага имеет овальную форму. Цитоплазма клетки достаточно большая, не имеет четких границ. Диаметр макрофага в норме колеблется в широких пределах: от 15 до 80 мкм.

Специфическими функциональными признаками макрофагов служат способность прилипать к стеклу, поглощение жидкости и более твердых частиц.

Фагоцитоз – «пожирание» чужеродных частиц макрофагами и нейтрофилами. Данное свойство клеток организма открыл И. И. Мечников в 1883 г.; он же предложил указанный термин. Фагоцитоз складывается из захвата клеткой чужеродной частицы и заключения ее в пузырек – фагосому. Образовавшаяся структура продвигается вглубь клетки, где переваривается при помощи ферментов, высвобождающихся из особых органелл – лизосом. Фагоцитоз представляет собой наиболее древнюю и важную функцию макрофагов, благодаря которой они избавляют организм от чужеродных неорганических элементов, разрушенных старых клеток, бактерий, а также иммунных комплексов. Фагоцитоз – одна из основных систем защиты организма, одно из звеньев иммунитета. В макрофагах его ферменты, так же как многие другие структуры, подчинены роли данных кровяных клеток в иммунитете и в первую очередь – фагоцитарной функции.

В настоящее время известно более 40 веществ, продуцируемых микрофагом. Ферментами моноцитов и макрофагов, реализующими переваривание образующихся фагосом, являются пероксидаза и кислая фосфатаза. Пероксидаза содержится только в таких клетках, как монобласты, промоноциты и незрелые моноциты. В клетках последних двух стадий дифференцировки пероксидаза присутствует в очень малом количестве. Зрелые клетки и макрофаги настоящий фермент, как правило, не содержат. Содержание кислой фосфатазы увеличивается в процессе созревания моноцитов. Наибольшее ее количество – в зрелых макрофагах.

Из поверхностных маркеров моноцитов и макрофагов иммунному фагоцитозу способствуют рецепторы к Fc-фрагменту иммуноглобулина G и к компоненту комплемента С 3 . С помощью указанных маркеров на поверхности моноцитарно-макрофагальных клеток закрепляются иммунные комплексы, антитела, различные клетки крови, покрытые антителами или комплексами, состоящими из антитела и комплемента, которые затем втягиваются внутрь клетки, осуществляющей фагоцитоз, и перевариваются ею либо сохраняются в фагосомах.

Кроме фагоцитоза, моноциты и макрофаги обладают способностью к хемотаксису, т. е. способны двигаться в направлении разности содержания определенных веществ в клетках и вне клеток. Также данные кровяные клетки могут переваривать микробы и продуцировать несколько компонентов комплемента, играющих ведущую роль в образовании иммунных комплексов и в активации лизиса антигена, продуцировать интерферон, ингибирующий размножение вирусов, секретировать особый белок лизоцим, обладающий бактерицидным действием. Моноциты и макрофаги продуцируют и секретируют фибронектин. Данное вещество является по своей химической структуре гликопротеидом, связывающим продукты клеточного распада в крови, играющим важную роль во взаимодействии макрофага с иными клетками, в прикреплении (адгезии) на поверхности макрофага элементов, подлежащих фагоцитозу, что связано с наличием на мембране макрофага рецепторов к фибронектину.

С защитной функцией макрофага связана также его способность продуцировать эндогенный пироген, представляющий собой специфический белок, который синтезируется макрофагами и нейтрофилами в ответ на фагоцитоз. Выделяясь из клетки, данный белок оказывает влияние на центр терморегуляции, расположенный в головном мозге. В результате повышается установленная указанным центром температура тела. Обусловленное воздействием эндогенного пирогена повышение температуры тела способствует борьбе организма с инфекционным агентом. Способность к выработке эндогенного пирогена увеличивается по мере созревания макрофагов.

Макрофаг не только организует систему неспецифического иммунитета, заключающуюся в защите организма от любого инородного вещества или клетки, постороннего для данного организма или ткани, но и принимает непосредственное участие в специфическом иммунном ответе, в «представлении» чужеродных антигенов. Данная функция макрофагов связана с существованием на их поверхности особого антигена. HLA-DR-белок играет предопределяющую роль в развитии специфического иммунного ответа. У человека существует 6 вариантов молекулы HLA-DR-подобного белка. Этот белок присутствует практически у всех кроветворных клеток, начиная от уровня полипотентных клеток-предшественниц, но отсутствует на зрелых элементах, имеющих кроветворную природу. HLA-DR-подобный белок определяется и у эндотелиальных клеток, и у сперматозоидов, и у многих других клеток человеческого организма. На поверхности незрелых макрофагов, имеющихся преимущественно в тимусе и селезенке, также присутствует HLA-DR-подобный белок. Самое большое содержание такого белка обнаружено на дендритических клетках и на клетках Лангерганса. Такие макрофагальные клетки являются активными участниками иммунного ответа.

Чужеродный антиген, попадающий в организм человека, адсорбируется поверхностью макрофага, поглощается им, оказываясь на внутренней поверхности мембраны. Затем антиген расщепляется в лизосомах. Фрагменты расщепленного антигена выходят из клетки. Часть этих фрагментов антигена взаимодействует с молекулой HLA-DR-подобного белка, в результате чего образуется комплекс на поверхности макрофага. Такой комплекс выделяет интерлейкин I, поступающий к лимфоцитам. Этот сигнал воспринимается Т-лимфоцитами. У Т-лимфоцита-амплифайера возникает рецептор к HLA-DR-подобному белку, ассоциированному с фрагментом чужеродного антигена. Активированный Т-лимфоцит выделяет второе сигнальное вещество – интерлейкин II и ростовой фактор для лимфоцитов всех типов. Интерлейкин II активирует Т-лимфоциты-хелперы. Два клона лимфоцитов данного типа отвечают на действие чужеродного антигена, продуцируя фактор роста В-лимфоцитов и фактор дифференцировки В-лимфоцитов. Результатом активации В-лимфоцитов является продукция специфических к данному антигену иммуноглобулинов-антител.

Таким образом, несмотря на то что распознавание чужеродного антигена является функцией лимфоцитов без участия макрофага, переваривающего антиген и соединяющего часть его с HLA-DR-подобным белком поверхности, невозможны представление антигена лимфоцитам и иммунный ответ на него.

Макрофаги обладают способностью переваривать не только бактериальные клетки, эритроциты и тромбоциты, на которых фиксированы некоторые компоненты комплемента, в том числе стареющие или патологически измененные, но также и опухолевые клетки. Такой вид активности макрофагов получил название тумороцидной. Из этого нельзя сделать вывод о действительной борьбе макрофагов с опухолью, а именно «признании» ими такого типа клеток как чужеродной ткани, в связи с тем что в любой опухоли присутствует очень много стареющих клеток, подлежащих фагоцитозу аналогично всем неопухолевым стареющим клеткам.

Отдельные факторы, продуцируемые клетками моноцитарно-макрофагальной природы (например, простагландины Е, лизоцим, интерферон), участвуют и в иммунной функции, и в кроветворении. Кроме того, макрофаги помогают развитию эозинофильной реакции.

Доказана макрофагальная природа остеокластов. Макрофаги способны, во-первых, непосредственно растворять костную ткань, во-вторых, стимулировать продукцию остеокластстимулирующего фактора Т-лимфоцитов.

Данная функция макрофагов может оказаться ведущей в патологии, обусловленной опухолевой и реактивной пролиферацией макрофагов.

Весьма существенную роль играют макрофаги в постоянстве внутренней среды. Прежде всего они являются единственными клетками, продуцирующими тканевой тромбопластин, и запускают сложный каскад реакций, обеспечивающих свертывание крови. Однако, по-видимому, повышение тромбогенной активности в связи с жизнедеятельностью макрофагов может быть обусловлено также обилием как секретируемых ими, так и внутриклеточными, выделяемыми при распаде клеток, протеолитических ферментов, продукцией простагландинов. Вместе с тем макрофаги продуцируют активатор плазминогена – антисвертывающий фактор.

Авторы

Сарбаева Н.Н., Пономарева Ю.В., Милякова М.Н.

В соответствии с «М1/М2» парадигмой выделяют два подтипа активированных макрофагов – классически активированные (М1) и альтернативно активированные (М2), которые экспрессируют различные рецепторы, цитокины, хемокины, факторы роста и эффекторные молекулы. Однако данные последних лет указывают на то, что в ответ на изменение сигналов микроокружения, макрофаги могут проявлять уникальные свойства, не позволяющие отнести их ни к одному из этих подтипов.

Макрофаги играют главную роль в реакции организма на имплантируемый материал – катетеры, стенты, эндопротезы, дентальные имплантаты. Макрофаги фагоцитируют частицы износа поверхности суставных протезов, инициируют воспаление в зоне протезирования и остеолиз, управляют процессами образования фиброзной капсулы вокруг инородных тел. Представлен краткий обзор факторов, вызывающих миграцию, адгезию и активацию макрофагов, анализ их функциональных характеристик на различных поверхностях, включая биодеградирующие и не деградирующие материалы in vivo и in vitro.

Введение

Современную медицину в настоящее время невозможно представить без применения имплантируемых изделий, устанавливаемых в организм на различные сроки с целью восстановления анатомии и функции утраченных или пораженных патологическим процессом органов и тканей. Биосовместимость синтетических материалов или тканеинженерных конструкций является основной проблемой, влияющей на результаты таких имплантаций. Реакция на протезирующий материал развивается в следующей последовательности: альтерация тканей, инфильтрация клетками острого, затем хронического воспаления с формированием грануляционной ткани и фиброзной капсулы. Степень выраженности этих реакций определяет биосовместимость имплантируемого изделия. Макрофаги играют главную роль в реакции организма на устанавливаемый материал – катетеры, стенты, эндопротезы, дентальные имплантаты и др.

Морфология макрофагов

Макрофаги – это гетерогенная клеточная популяция. Макрофаг имеет неправильную, звездчатую, многоотростчатую форму, складки и микроворсинки на поверхности клеток, обилие эндоцитозных микровезикул, первичных и вторичных лизосом. Округлое или эллипсовидное ядро расположено центрально, гетерохроматин локализован под ядерной оболочной. Структурные особенности клетки во многом зависят от ее органной и тканевой принадлежности, а также от функционального статуса. Так, для клеток Купфера характерен гликокаликс, альвеолярные макрофаги содержат ламеллярные (сурфактантные) тельца, хорошо развитый комплекс Гольджи, шероховатый эндоплазматический ретикулум и множество митохондрий, в то время как в клетках микроглии митохондрии немногочисленны. В цитоплазме перитонеальных и альвеолярных макрофагов присутствует большое количество липидных телец, содержащих субстраты и ферменты генерации простагландинов . Адгезирующиеся и движущиеся макрофаги формируют короткоживущие, содержащие актин структуры – подосомы – в виде плотной центральной части с радиально отходящими от них микрофиламентами. Подосомы могут сливаться, формируя структуры более высокого порядка – розетки, которые эффективно разрушают белки подлежащего внеклеточного матрикса .

Функции макрофагов

Макрофаги фагоцитируют чужеродный материал и клеточно-тканевый детрит, стимулируют и регулируют иммунный ответ, индуцируют воспалительную реакцию, участвуют в репаративных процессах и обмене компонентов внеклеточного матрикса. Многообразие осуществляемых функций объясняет экспрессию этими клетками большого числа рецепторов, связанных с плазматической мембраной, внутриклеточных и секретируемых. Рецепторы врожденного иммунитета РRR (pattern-recognition receptors, образ-распознающие рецепторы) активируются широким спектром лигандов (исключение – CD163), обеспечивая узнавание высоко консервативных структур большинства микроорганизмов, так называемых PAMP (pathogen-associated molecular patterns, патоген-ассоциированные образы) и схожих с ними эндогенных молекулярных структур DAMP (damage-associated molecular patterns), образующихся в результате повреждения и гибели клеток, модификации и денатурации белковых структур внеклеточного матрикса. Большинство из них опосредует эндоцитоз и элиминацию потенциально опасных эндогенных и экзогеннных агентов, однако вместе с тем, многие из них выполняют сигнальные функции, регулируя синтез провоспалительных медиаторов, способствуя адгезии и миграции макрофагов (табл.) .

На плазматической мембране моноцитов/макрофагов экспрессируются также специализированные рецепторы, связывающие один или несколько близких по строению лигандов: Fc-фрагмент иммуноглобулина G, факторы роста, кортикостероиды, хемокины и цитокины, анафилотоксины и костимулирующие молекулы. Функции многих из этих рецепторов опосредованы не только связыванием лигандов, но и взаимодействием с другими рецепторами (C5aR-TLR, MARCO-TLR, FcγR-TLR), что обеспечивает тонкую регуляцию синтеза прои противовоспалительных медиаторов . Особенностью макрофагальной рецепторной системы является наличие рецепторов-ловушек провоспалительных цитокинов и хемокинов (Il-1R2 на М2а макрофагах; CCR2 и CCR5 на М2с макрофагах), активация которых блокирует внутриклеточную передачу соответствующего провоспалительного сигнала. Экспрессия клеточных рецепторов видо-, органо- и тканеспецифична и зависит от функционального статуса макрофагов. Детально изученные клеточные рецепторы макрофага приведены в таблице.

Миграция моноцитов/макрофагов

Тканевые макрофаги происходят преимущественно из моноцитов крови, которые мигрируют в ткани и дифференцируются в различные популяции. Миграция макрофагов направляется хемокинами: ССL2 CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, ССL15, ССL19, CXCL10, CXCL12; факторами роста VEGF, PDGF, TGF-b; фрагментами системы комплемента; гистамином; белками гранул полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ); фосфолипидами и их производными.

На начальных этапах воспалительного ответа ПМЯЛ организуют и модифицируют сеть хемокинов путем секреции CCL3, CCL4 и CCL19 и выброса преформированных в гранулы азуросидина, белка LL37, катепсина G, дефензинов (НNP 1-3) и протеиназы 3, которые обеспечивают адгезию моноцитов к эндотелию, тем самым проявляя свойства хемоаттрактантов. Кроме того, белки гранул ПМЯЛ индуцируют секрецию хемокинов и другими клетками: азуросидин стимулирует продукцию CCL3 макрофагами, а протеиназа-3 и HNP-1 вызывают синтез ССL2 эндотелием. Протеиназы ПМЯЛ способны активировать многие хемокины белковой природы и их рецепторы. Так, протеолиз ССL15 катепсином G многократно усиливает его аттрактивные свойства. Апоптозные нейтрофилы привлекают моноциты через сигналы, предположительно, опосредованные лизофосфатидилхолином .

Любое повреждение тканей приводит к аккумуляции макрофагов. В зоне травмы сосудов кровяной сгусток и тромбоциты выделяют TGF-β, PDGF, CXCL4, лейкотриен B4 и IL-1, обладающие выраженными хемоаттрактивными свойствами в отношении моноцитов/макрофагов . Поврежденные ткани являются источником так называемых аларминов, к которым относятся компоненты разрушенного внеклеточного матрикса, белки теплового шока, амфотерин, АТФ, мочевая кислота, IL-1a, IL-33, митохондриальная ДНК клеточного детрита и др. Они стимулируют оставшиеся жизнеспособными клетки поврежденных тканей и эндотелий кровеносных сосудов к синтезу хемокинов, некоторые из них являются прямыми факторами хемотаксиса . Инфицирование тканей приводит к появлению так называемых патогенассоциированных молекул: липополисахаридов, углеводов клеточной стенки и нуклеиновых кислот бактерий. Связывание их мембранными и внутриклеточными рецепторами макрофагов запускает процесс экспрессии генов хемокинов, обеспечивающих дополнительное рекрутирование фагоцитов .

Активация макрофагов

Макрофаги активируются под действием множества сигнальных молекул, вызывающих их дифференцировку в различные функциональные типы (рис. 1). Классически активированные макрофаги (М1 фенотип) стимулируются IFNg, а также IFNg совместно с LPS и TNF. Их основные функции – уничтожение патогенных микроорганизмов и индукция воспалительной реакции. Поляризация в М1 направлении сопровождается секрецией провоспалительных медиаторов. Они экспрессируют рецепторы к IL-1 – IL-1R1, TLR и костимулирующие молекулы, активация которых обеспечивает амплификацию воспалительного ответа. Наряду с провоспалительными цитокинами макрофаги секретируют и антивоспалительный цитокин – IL-10, при характерном высоком соотношении IL-12/IL-10 . Бактерицидные свойства М1 макрофагов определяются продукцией свободных радикалов азота и кислорода, генерируемых iNOS и НАДФН-оксидазным комплексом . Являясь эффекторными клетками в реакции организма на бактериальную инфекцию, они, в то же время, подавляют адаптивный иммунный ответ за счет торможения пролиферации стимулированных Т-клеток. Секретируемый М1 макрофагами IL-12 играет ключевую роль в Тх1 поляризации, а IL-1b и IL-23 направляют иммунный ответ по Тх17 пути. . Исследования последних лет показали, что М1 макрофаги помимо провоспалительных проявляют репаративные свойства: секретируют VEGF, стимулирующий ангиогенез и образование грануляционной ткани .

Альтернативная активация макрофагов (М2 фенотип) наблюдается при стимуляции их интерлейкинами, глюкокортикоидами, иммунными комплексами, агонистами TLR и др. Они мигрируют в зоны инвазии гельминтами, скапливаются в локусах фиброза, в заживающих ранах кожи и неопластических образованиях. М2 макрофаги способны к активной пролиферации in situ. Они проявляют большую по сравнению с М1 макрофагами способность к фагоцитозу и экспрессируют большее количество связанных с ним рецепторов: СD36 – рецептор скавенджер апоптозных клеток; CD206 – маннозный рeцептор; CD301 – рецептор остатков галактозы и N-ацетилглюкозамина; СD163 – рецептор к гемоглобин-гаптоглобиновому комплексу. Для макрофагов этого типа характерно низкое отношение IL-12/IL-10 .

Альтернативно активированные макрофаги подразделяют на подтипы: М2а, М2b и М2с. Примером М2а фенотипа макрофагов являются клетки, скапливающиеся вокруг личинок гельминтов и простейших, аллергены которых индуцируют иммунный Тх2 ответ, сопровождающийся продукцией IL-4 и IL-13 . Они не секретируют значительные количества провоспалительных цитокинов, синтезируют особый спектр хемокинов и мембранных рецепторов . Считается, что для них характерен синтез IL-10 , однако in vitro макрофаги не всегда продуцируют этот цитокин и могут проявлять высокую транскрипционную активность генов IL-12 и IL-6 . Важной характеристикой этой популяции является синтез антагониста рецептора IL-1 (IL-1ra), который, связываясь с IL-1, блокирует его провоспалительное действие .

М2а макрофаги подавляют воспалительную реакцию, блокируя формирование М1 популяции через цитокины рекрутированных ими Тх2-лимфоцитов, либо за счет вырабатываемого хемокина ССL17, который совместно с IL-10 ингибирует дифференцировку макрофагов в М1 направлении . Клетки М2а фенотипа считают типичными репаративными макрофагами. Синтезируемый ими хемокин CCL2 является хемоаттрактантом предшественников миофибробластов – фиброцитов , они секретируют факторы, обеспечивающие ремоделирование соединительной ткани .

Поляризация в направлении М2b осуществляется стимуляцией рецептора к Fcg вместе с агонистами ТLR и лигандами к рецептору IL-1. Функционально они близки к М1 макрофагам, продуцируют провоспалительные медиаторы и монооксид азота (NO), но вместе с тем для них характерен высокий уровень синтеза IL-10 и сниженная продукция IL-12 . М2b макрофаги усиливают продукцию антител. Синтезируемый ими хемокин ССL1 способствует поляризации лимфоцитов в Тх2 направлении . М2с макрофаги обладают супрессивными свойствами – тормозят активацию и пролиферацию СD4+-лимфоцитов, вызванную антигенной стимуляцией и способствуют элиминации активированных Т-клеток . In vitro М2с подтип получают стимуляцией мононуклеарных фагоцитов глюкокортикоидами, IL-10, TGF-β, простагландином Е2 и др. Они не обладают бактерицидной активностью, продуцируют незначительное количество цитокинов, секретируют факторы роста и некоторые хемокины . М2с макрофаги экспрессируют рецепторы фагоцитоза и многих провоспалительных хемокинов, которые, предположительно, служат не для возбуждения соответствующих сигналов, а являются ловушками провоспалительных медиаторов, блокируя их функции .

Характер активации макрофагов не является жестко детерминированным и стабильным. Показана возможность трансформации М1 фенотипа в М2 при изменении спектра стимулирующих цитокинов и вследствие эффероцитоза. После поглощения апоптозных клеток макрофаги резко снижают синтез и секрецию медиаторов воспаления ССL2, ССL3, CXCL1, CXCL 2, TNF-a, MG-CSF, IL-1b, IL-8 и многократно усиливают продукцию TGF-b . Обратная трансформация М2 фенотипа в М1 предполагается при развитии ожирения.

Многие авторы ставят под сомнение существование в организме двух четко различимых популяций макрофагов М1 и М2. Сочетание признаков классической и альтернативной активации характерно для макрофагов кожных ран человека. Так, наряду с типичными для M1 макрофагов цитокинами TNF-a и IL-12, они демонстрируют синтез маркеров М2 макрофагов: IL-10, СD206, СD163, CD36 и рецепторов к IL-4 . Отличный от М1/М2 тип макрофагов с выраженной фибринолитической активностью обнаружен в печени мышей на модели обратимого фиброза и в ткани печени человека при циррозе. В них экспрессируются гены аргиназы 1, маннозных рецепторов и IGF, они секретируют ММП-9, ММП-12, проявляют выраженную способность к пролиферации и фагоцитозу, но не синтезируют IL-10, IL-1ra, TGF-b . Особая популяция макрофагов формируется в селезенке мыши при инфицировании микобактериями. Они тормозят пролиферацию Т-лимфоцитов и секрецию ими как Тх1, так и Тх2 цитокинов, стимулируя поляризацию в Тх17. направлении. Супрессивные макрофаги обладают уникальным фенотипом – экспрессируют гены активные в М1 макрофагах – IL-12, IL-1b, IL-6, TNF-a, iNOS и одновременно гены CD163, IL-10, маннозных рецепторов и других маркеров М2 макрофагов .

Эти исследования наглядно показывают, что формирующиеся в естественных условиях популяции макрофагов значительно отличаются от получаемых in vitro М1 и М2 популяций. Воспринимая множество активирующих сигналов, макрофаг отвечает «по запросу», секретируя медиаторы адекватно изменению окружающей среды, поэтому в каждом конкретном случае формируется свой фенотип, иногда, возможно, даже уникальный.

Реакция макрофагов на чужеродный материал

Контакт макрофагов с чужеродным материалом, как в виде мелких частиц, так и в виде обширных поверхностей, приводит к их активации. Одной из серьезных проблем в травматологии и ортопедии, связанной с реакцией на инородное тело, является развитие нестабильности сустава после эндопротезирования, которая выявляется, по некоторым данным, у 25–60% больных в первые годы после выполненной операции и не имеет тенденции к снижению .

Поверхность ортопедических протезов изнашивается с образованием частиц, инфильтрирующих мягкие ткани. Химические свойства материала определяют возможность опсонизации частиц белками плазмы крови и тип поверхностных рецепторов, инициирующих фагоцитоз. Так, полиэтилен, активирующий комплемент, подвергается опсонизации и «узнается» рецептором к комплементу СR3, в то время как частицы титана поглощаются клеткой через опсонин-независимый рецептор MARCO. Фагоцитоз макрофагами частиц металла, синтетических полимеров, керамики, гидроксиапатита запускает процесс синтеза провоспалительных медиаторов и индуктора остеокластогенеза RANKL. Секретируемый макрофагами ССL3 вызывает миграцию остеокластов, а IL-1b, TNF-a, ССL5 и PGE2 стимулируют их дифференцировку и активацию. Остеокласты резорбируют кость в зоне протезирования, но новообразование костной ткани подавлено, поскольку корпускулярный материал ингибирует синтез коллагена, тормозит пролиферацию и дифференцировку остеобластов и индуцирует их апоптоз . Вызванный частицами износа воспалительный ответ считается основной причиной остеолиза.

Контакт тканей с материалом, который не может быть фагоцитирован, инициирует каскад событий, известный под названием реакции организма на инородное тело, или тканевой реакции. Она заключается в адсорбции белков плазмы, развитии воспалительного ответа, первоначально острого, впоследствии хронического, пролиферации миофибробластов и фибробластов и формировании фиброзной капсулы, отграничивающей инородное тело от окружающих тканей. Основными клетками персистирующего воспаления на границе материал/ткань являются макрофаги, его выраженность определяет степень фиброза в зоне контакта. Интерес к исследованию тканевой реакции связан в первую очередь с широким применением синтетических материалов в различных областях медицины .

Адсорбция белков плазмы крови является первой стадией взаимодействия имплантируемых материалов с тканями организма. Химический состав, свободная энергия, полярность поверхностных функциональных групп, степень гидрофильности поверхности определяют количество, состав и конформационные изменения в связываемых белках, являющихся матриксом для последующей адгезии клеток, в том числе макрофагов. Наиболее значимыми в этом плане являются фибриноген, IgG, белки системы комплемента, витронектин, фибронектин и альбумин.

Слой фибриногена быстро образуется на практически всех чужеродных материалах. На гидрофобных поверхностях фибриноген образует монослой из прочно связанного, частично денатурированного белка, эпитопы которого открыты для взаимодействия с клеточными рецепторами. На гидрофильных материалах фибриноген чаще осаждается в виде рыхлого мультислойного покрытия, причем наружные слои слабо или практически не подвергаются денатурации, оставляя сайты связывания недоступными для клеточных рецепторов макрофагов и тромбоцитов .

Многие синтетические полимеры обладают способностью к сорбции компонентов системы комплемента и ее активации с формированием С3-конвертазного комплекса. Генерируемые им фрагменты С3а, С5а являются хемоаттрактантами и активаторами фагоцитов, iC3b выполняет роль лиганда рецептора клеточной адгезии. Запуск каскада активации возможен как по классическому (опосредованному адсорбированными молекулами JgG), так и по альтернативному путям . Последний инициируется связыванием компонента С3 поверхностями, несущими функциональные группы, например – ОН-, вызывающими его гидролиз. Альтернативный путь может включаться также после классического пути или вместе с ним за счет работы С3-конвертазы классического пути, генерирующей фиксирующиеся на поверхностях фрагменты С3b – пускового фактора амплификационной петли. Однако сорбция и даже начавшийся гидролиз С3 не всегда приводят к возникновению амплификационного сигнала. Например, С3 сильно сорбируется поливинилпирролидоном, однако протеолиз его на этой поверхности слабо выражен. Слабо активируют комплемент фторированные поверхности, силикон и полистирен. Для клеточных реакций на чужеродных поверхностях значение имеет не только активация системы комплемента, но опосредованное ее фрагментами связывание других белков.

Роль альбумина заключается в его способности связывать белки системы комплемента . Oн не способствует адгезии макрофагов и, в отличие от фибриногена, не индуцирует синтез ими TNF-a . На имплантированных материалах обычно обнаруживают фибронектин и витронектин – белки богатые RGD-последовательностями (участками из аминокислот ARG-GLY-ASP).

В отношении витронектина неизвестно, адсорбируется ли он непосредственно на поверхности материала или входит в состав фиксированного на нем инактивированного мебранноатакующего комплекса комплемента. Значимость его для развития тканевой реакции состоит в том, что он обеспечивает наиболее прочную и длительную адгезию макрофагов. Взаимодействие макрофагов с субстратом обеспечивают клеточные рецепторы к белкам-интегринам (avβ3, a5β1, CR3), богатым RGDпоследовательностями (табл.). Блокада адгезии макрофагов растворимыми RGD-миметиками, либо удаление с их поверхности рецептора CR3 снижает интенсивность тканевой реакции, уменьшая толщину формирующейся фиброзной капсулы .

Прикрепившиеся макрофаги сливаются, образуя многоядерные клетки (гигантские клетки инородных тел – ГКИТ). Индукторами этого процесса являются IFNg, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-13 и GM-CSF, стимулирующие экспрессию маннозных рецепторов, которые играют важную роль в слиянии клеток . ГКИТ функционируют как макрофаги – обладают способностью к фагоцитозу, генерации радикалов кислорода и азота, синтезу цитокинов и факторов роста. Характер синтетической активности этих клеток зависит, по-видимому, от их «возраста»: на ранних этапах развития тканевой реакции экспрессируются IL-1a, TNF-a, а позднее происходит переключение на антивоспалительные и профиброгеннные медиаторы – IL-4, IL-10, IL-13, TGF-β .

Реакция макрофагов на чужеродные материалы исследуется в различных условиях in vitro и in vivo. В экспериментах in vitro принимается во внимание интенсивность их адгезии на изучаемой поверхности и образования ГКИТ, число «включающихся» генов, количество синтезируемых и секретируемых ферментов, цитокинов и хемокинов. В монокультурах мононуклеарных фагоцитов, адгезированных на различных поверхностях, происходит не поляризация их в М1 и М2 направлениях, а формирование макрофагов смешанного типа, секретирующих как про-, так и противовоспалительные медиаторы со сдвигом в сторону последних при длительном культивировании . Отсутствие «золотого стандарта» – стабильного контрольного материала, хорошо зарекомендовавшего себя при имплантации в живой организм, с которым можно было бы сравнивать тестируемые материалы, а также использование не стандартизированных клеточных линий макрофагов, разные способы их дифференцировки затрудняют сравнение результатов работ разных авторов. Тем не менее, исследования in vitro дают возможность судить о цитотоксичности материалов, определить реакцию макрофагов на их химическую модификацию. Ценные сведения были получены при изучении активации макрофагов на поверхности различных коллагенов – нативных и химически измененных. Нативные коллагены индуцируют in vitro синтез макрофагами сигнальных молекул, как стимулирующих воспалительный ответ (TNF-a, IL-6, IL-8, IL-1β, IL-12, CCL2), так и подавляющих его (IL-1ra, IL-10), а также матриксных металлопротеаз и их ингибиторов. . Провоспалительные свойства таких материалов зависят от способа децеллюляризации и стерилизации исходного сырья, в значительной степени изменяющих его характеристики. Полученные по разным технологиям коллагеновые эндопротезы из нативного коллагена по способности вызывать экспрессию провоспалительных цитокинов варьируют от практически инертных до высокоактивных . Прошивка коллагена различными химическими веществами изменяет характер реакции макрофагов. Обработка глутаральдегидом приводит к цитотоксичности, проявляющейся в повреждении цитоплазматической мембраны, нарушении адгезии, снижении жизнеспособности макрофагов. При этом продукция ими IL-6, TNF-a повышена, а синтез IL-1ra подавлен в сравнении с макрофагами, адгезированными нативным и прошитым карбодиимидом коллагеном. Обработка карбодиимидом обеспечивает оптимальные свойства коллагену, который не обладает цитотоксичностью, не вызывает существенного повышения секреции провоспалительных цитокинов и металлопротеаз и не подавляет синтез IL-10 и IL-1ra в сравнении с нативным .

С целью снижения тканевой реакции в коллагеновые материалы вводят компоненты межклеточного матрикса, нативные или модифицированные. J. Kajahn с соавт. (2012) создали in vitro имитацию провоспалительного микроокружения эндопротезов, что способствовало дифференцировке моноцитов в М1 направлении . В этих же условиях дополнительно сульфатированная гиалуроновая кислота, введенная в коллагеновый субстрат, снизила секрецию макрофагами провоспалительных цитокинов и повысила продукцию IL-10. По мнению авторов это свидетельствует о М2 поляризации макрофагов, способствующих регенерации и восстановлению функциональных свойств окружающих тканей. Реакция макрофагов на медленно деградируемые и стабильные материалы in vitro в целом однородна и аналогична реакции на биоматериалы, хотя некоторая специфичность ответа все же заметна. Титан, полиуретан, полиметилметакрилат, политетрафторэтилен являются слабыми индукторами медиаторов воспаления, хотя титан способствует более высокой секреции TNF-a и IL-10, чем полиуретан, а особенность полипропилена заключается в стимулировании продукции профиброгенного хемокина ССL18 . PEG, предлагаемый в качестве субстрата для переноса клеток, вызывает резкое, но быстро проходящее усиление экспрессии IL-1β, TNF-a, IL-12, однако его сополимеризация с олигопептидом клеточной адгезии улучшает биосовместимость материала, в значительной степени снижая экспрессию провоспалительных цитокинов .

Реакция макрофагов на различные материалы in vitro не в полной мере характеризует их поведение в организме. В монокультурах отсутствуют факторы взаимодействия с другими клеточными популяциями и не учитывается фенотипический полиморфизм – в естественных условиях к имплантату мигрируют не только моноцитарные предшественники, но и зрелые тканевые макрофаги, ответ которых может существенно отличаться от рекрутируемых из крови. Исследование секреторной активности макрофагов, окружающих инсталлированные в ткани животных и человека эндопротезы, представляет большую сложность. Основным методом, позволяющим характеризовать макрофаги на основании парадигмы М1-М2 in situ, стали данные иммуноцитохимии маркерных белков iNOS, CD206, CD163, CD80, CD86. Постулируется, что наличие этих маркеров у макрофагов in vivo определяет их поляризацию в М1 и М2 направлениях с синтезом соответствующих спектров цито- и хемокинов, но, учитывая возможность существования макрофагов смешанного типа , такая характеристика не вполне корректна.

Тем не менее, эксперименты in vivo дают возможность проследить судьбу имплантированного материала и динамику реакции макрофагов в течение длительного периода, что особенно важно для пожизненно установленных эндопротезов и устройств. Наиболее изученными в данном аспекте являются деградирующие биоматериалы на основе коллагена. Первыми клетками воспаления, мигрирующими к таким материалам, являются ПМЯЛ, однако этот эффект транзиторный и популяция второй волны представлена макрофагами . Их реакция зависит от физико-химических свойств коллагена. Чем жестче химическая обработка, тем больше отличается коллаген от нативного, тем более «чужим» он становится для макрофага и тем сильнее выражена тканевая реакция. Установленные между мышечными слоями брюшной стенки крысы фрагменты имплантатов из медленно деградирующего прошитого коллагена способствуют формированию ГКИТ и инкапсуляции материала. Мигрирующие макрофаги, судя по экспрессии рецепторов ССR7 и CD206, можно отнести в ряде случаев к М1 фенотипу, но во многих случаях определить их принадлежность к известным фенотипам не представляется возможным.

С течением времени вокруг имплантата появляются М2 макрофаги, которые располагаются преимущественно в фиброзной капсуле . Эндопротезы из непрошитого коллагена свиньи, человека и быка и прошитый диизоцианатом коллаген овцы , быстро разрушающиеся в организме крысы, стимулируют новообразование полноценной соединительной и мышечной тканей. Они не способствуют образованию ГКИТ и не инкапсулируются. Часть мононуклеарных фагоцитов, скапливающихся на границе ткань/материал, не имеет маркеров М1/М2 фенотипа, часть содержит оба маркера, а часть является М2 макрофагами. Субпопуляция М1 макрофагов на таких имплантатах отсутствует . Гистоморфометрический анализ показал положительную корреляцию между количеством макрофагов, несущих маркеры М2 фенотипа на ранних этапах развивающейся тканевой реакции, и показателями успешного ремоделирования тканей в зоне имплантации .

Тканевая реакция на недеградируемые материалы существует в течение всего времени присутствия их в организме . Ее интенсивность модулируется физико-химическими свойствами материалов: в ряду полиэстер, политетрафторэтилен, полипропилен – первый полимер вызывает максимально выраженное воспаление и слияние макрофагов, последний – минимальное, а выраженность фиброза для всех перечисленных материалов положительно коррелирует с количеством ГКИТ на поверхности синтетических полимеров . Несмотря на большое количество работ, в которых исследована воспалительная реакция на различные материалы, характеристики аккумулирующихся на них макрофагов изучены недостаточно. M.T. Wolf и соавт. (2014) показали, что на нитях и между узлами полипропиленовой сетки, имплантированной в брюшную стенку крысы, скапливаются преимущественно макрофаги с маркерами М1 фенотипа (СD86+CD206-) .

Нанесенный на полипропилен гель из межклеточного матрикса соединительной ткани снижает число М1 макрофагов и ГКИТ и одновременно тормозит рост микрососудов. Это явление хорошо согласуется с результатами работ, демонстрирующими экспрессию ангиогенных факторов М1 макрофагами ран и подавление васкулогенеза при их блокаде . О синтетической активности макрофагов, спектре их биологически активных молекул, обеспечивающих тканевую реакцию, известно мало. У мыши на периферии зоны имплантации нейлоновой сетки скапливаются макрофаги, секретирующие IL-6 и ССL2, IL-13 и TGF-β и в то же время в популяции клеток, в том числе и в ГКИТ, адгезированных на волокнах эндопротеза, экспрессируются IL-4, IL-10, IL-13 и TGF-β . IL-4 и IL-13 – мощные профиброгенные медиаторы, они не только поляризуют макрофаги в М2а направлении, способствуя продукции факторов роста, но и через индукцию экспрессии фибробластами TGF-β, стимулируют синтез ими коллагена. Профиброгенным эффектом обладают также IL-10 и CCL2, обеспечивающие хемотаксис предшественников миофибробластов – фиброцитов . Можно предположить, что именно макрофаги создают среду, способствующую развитию фиброза вокруг недеградирующих материалов.

Образование фиброзной ткани может оказывать как негативное, так и позитивное влияние на результаты лечения пациентов. В герниологической практике фиброзная трансформация тканей, связанная с имплантацией полипропиленового эндопротеза, является одной из основных проблем (рис. 2, собственные данные), которая на фоне нерациональной оперативной тактики в 15–20% случаев приводит к развитию рецидивов грыж различных локализаций .

В последние годы особенно интенсивно развиваются технологии дентальной имплантации, основанные на интеграции установленных конструкций за счет развития соединительной ткани (рис. 3, собственные данные). Несмотря на то, что фиброинтеграция имплантатов рядом специалистов признается как допустимый вариант, поиск новых материалов, способствующих процессам остеоинтеграции, продолжается .

В этой связи существенное значение приобретают изучение клеточных популяций в зоне протезирования, разработка методов и подходов к блокированию чрезмерной воспалительной реакции с исходом в фиброз и стимуляция репаративной регенерации в месте имплантации различных материалов.

Заключение

Макрофаги – полиморфная популяция клеток, фенотип которых определяется сигналами микроокружения. Они играют решающую роль в реакции организма на чужеродный материал, используемый для эндопротезирования, катетеризации, стентирования и др. видов лечения. Характер реакции и степень ее выраженности зависят как от размера имплантируемого материала, так и от его физикохимических свойств и могут иметь как положительное, так и отрицательное значения для организма пациента. Для деградируемых материалов на основе коллагена показана зависимость типа активации макрофагов и скорости регенерации соединительной ткани от способа обработки коллагенового сырья. Это открывает широкие возможности для специалистов, разрабатывающих новые методы децеллюляризации тканей, химической модификации и стерилизации коллагеновых материалов в целях получения имплантатов для регенеративной медицины.

Проблемы, связанные с активацией макрофагов недеградирующими материалами, по-видимому, должны решаться иначе. Макрофаги, фагоцитирующие микрочастицы износа поверхности суставных эндопротезов, и макрофаги, мигрирующие к обширным поверхностям синтетических имплантов, инициируют длительно персистирующее воспаление, остеолиз в первом случае и фиброз во втором. Нивелирование этого эффекта, скорее всего, будет достигнуто путем блокады направленной миграции, адгезии и активации моноцитов/макрофагов, что потребует более глубоких знаний об этих процессах, чем те, которыми мы располагаем в настоящее время.