Методы идентификации белков. Методы выделения, очистки, идентификации и изучения мембранных структур. Подготовка к проведению анализа

Книга представляет собой первое учебное пособие на русском языке по основам масс-спектрометрии белков и пептидов. Цель настоящего издания - заинтересовать молодых исследователей информативной, красивой и востребованной во всем мире дисциплиной, дать возможность более эффективно применять масс-спектрометрию для решения фундаментальных и прикладных научных задач. Книга написана в формате лекций для начинающих, хорошо иллюстрирована и сопровождается представительным списком цитированной литературы.

Издание рассчитано на студентов и аспирантов химических, физико-химических, биологических и медицинских специальностей; будет полезно научным сотрудникам, уже работающим в области исследований белков и пептидов или интересующимся этим научным направлением.

		7
Использованные сокращения		9
Введение		11
Глава 1. Методы ионизации молекул пептидов и белков		14
1.1. Бомбардировка быстрыми атомами, БВА (Fast Atom Bombardment, FAB)		14
1.2. Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация, МАЛДИ (Martix Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) 16
1.3. Ионизация электрораспылением, ИЭР (Electrospray Ionization, ESI)		19
Глава 2. Измерение молекулярной массы пептидов и белков		25
Глава 3. Установление первичной структуры пептидов		34
3.1. Деградация по Эдману		34
3.2. Идентификация пептидов по сиквенсу кДНК		36
3.3. Леддерное секвенирование		37
Глава 4. Масс-спектрометрическое секвенирование		39
4.1. Номенклатура фрагментных ионов пептидов		39
4.2. Масс-спектры отрицательных ионов		45
4.3. Методы инициирования фрагментации молекулярных ионов 46
4.3.1. Диссоциация, активированная соударениями, ДАС (Collisionally Activated Dissociation, CAD)		47
4.3.2. Диссоциация индуцированная столкновениямис поверхностью, ДИП (Surface Induced Dissociation (SID)		56
4.3.3. Диссоциация при захвате электрона, ДЗЭ(Electron Capture Dissociation, ECD)		59
4.3.4. Диссоциация при переносе электрона, ДПЭ(Electron Transfer Dissociation, ETD)		64
4.3.5. Фотоактивация диссоциации		65
4.3.6. Диссоциация, активированная электронами		69
4.3.7. Диссоциация отрицательных ионов при отрывеэлектрона		70
4.4. Методы секвенирования пептидов на приборах с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией		71
4.4.1. Метод задержанной экстракции. Распад в источнике, РВИ (In Source Decay, ISD)		71
4.4.2. Распад за пределами источника, РПИ (Post Source Decay, PSD)		72
Глава 5. Идентификация белков и пептидов		7 6
5.1. Идентификация с использованием баз данных		76
5.1.1. Метод идентификации белков "снизу вверх"("Bottom-up")		76
5.1.2. Метод идентификации белков "сверху вниз"("Top-down")		91
5.2. Ручная идентификация пептидов		94
Глава 6. Основные сложности масс-спектрометрическогосеквенирования пептидов и пути их преодоления		97
6.1. Покрытие сиквенса		98
6.2. Аминокислоты с одинаковой целочисленной массой		102
6.2.1. Лизин и глутамин		102
6.2.2. Фенилаланин и окисленный метионин		104
6.3. Изомерные аминокислоты: лейцин и изолейцин		106
6.4. Циклизация коротких пептидов		108
6.5. Пептиды, содержащие дисульфидную связь		116
Глава 7. Использование для секвенирования масс-спектровотрицательных ионов		121
Глава 8. Количественный анализ белков с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографиимасс-спектрометрии. Количественная протеомика		126
8.1. Сравнительная (количественная) протеомика		129
8.1.1. Безизотопный метод		129
8.1.2. Изотопные методы		132
8.2. Установление абсолютных количеств		145
Список литературы		149
Приложение. Bruker: Многомерный путь к разгадке протеома		163

Предисловие

Посвящается
профессорам химического факультета
МГУ им. М.В. Ломоносова
Александру Леонидовичу Курцу
Киму Петровичу Бутину

Важнейшие достижения масс-спектрометрии за последние 20 лет связаны с исследованиями природных соединений, включая биополимеры. С появлением методов ионизации электрораспылением и матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации для масс-спектрометрии стали доступны сахара, нуклеиновые кислоты, белки, липиды и прочие биоорганические макромолекулы. Безусловно, наибольших успехов удалось достичь в исследовании белков. Благодаря чувствительности, информативности, экспрессности, возможности работать со смесями, масс-спектрометрия сегодня - основной метод анализа этих сложных для изучения объектов.

Пожалуй, можно признать, что современная масс-спектрометрия выиграла конкурентную борьбу с классическим методом установления первичной последовательности аминокислот в пептидах по Эдману, поскольку масс-спектрометрическое секвенирование оказалась существенно быстрее, чувствительнее, информативнее и даже дешевле. Быстрое и надежное определение первичной структуры белков, т.е. последовательности аминокислотных звеньев, само по себе уже превосходный результат. Однако масс-спектрометрия способна изучать структуры более сложных порядков (от 2 до 4), включая нековалентные взаимодействия белков с появлением надбелковых образований, устанавливать тип и место посттрансляционных модификаций, работать с гликопротеинами, липопротеинами, фосфопротеинами и т.д. Масс-спектрометрия стала незаменимой в медицине, поскольку способна быстро и надежно диагностировать сердечно-сосудистые, генетические и онкологические заболевания. Именно успехи масс-спектрометрии привели к формированию в конце прошлого века нового научного направления - протеомики. Огромна роль метода и в метаболомике.

К сожалению, в русскоязычной литературе до сих пор не существовало учебных пособий или монографий по этой важнейшей и многогранной по своему применению тематике. Россия кардинально отстает от развитых стран и по изучению этой дисциплины, и по использованию ее достижений. Масс-спектрометристам, работающим в России, приходится ориентироваться на англоязычные издания книг, оригинальные статьи и обзоры. В 2012 г. на русском языке была издана книга "Принципы масс-спектрометрии в приложении к биомолекулам" под редакцией Дж. Ласкин и X. Лифшиц (перевод с английского, изд-во "Техносфера"), представляющая собой сборник статей ведущих специалистов в области масс-спектрометрии в приложении к биологии. Книга рассчитана на подготовленных читателей. Она предоставляет

хорошую, во многом, заочную возможность познакомиться с современными достижениями в области масс-спектрометрии биомолекул, поскольку большинство описываемых в ней методов пока не используется в нашей стране.

Предлагаемая читателям книга "Основы масс-спектрометрии белков и пептидов" является первым учебным пособием на русском языке, излагающим основы масс-спектрометрии белков и пептидов. Книга написана в формате лекций для начинающих, иллюстрирована большим количеством рисунков, спектров, схем и сопровождается представительным списком цитированной литературы. Она рассчитана на студентов и аспирантов химических, физико-химических, биологических и медицинских специальностей; будет полезна научным сотрудникам, уже работающим в области исследований белков и пептидов или интересующимся этим научным направлением.

Цель издания такой книги - заинтересовать молодых исследователей информативной, очень красивой и востребованной во всем мире дисциплиной, дать возможность более эффективно применять масс-спектрометрию для решения своих собственных фундаментальных и прикладных научных задач.

Основное внимание в учебном пособии уделено методам ионизации белков и пептидов, процессам фрагментации этих соединений в газовой фазе. Достаточно подробно рассматриваются вопросы тандемной масс-спектрометрии, существующие методы инициирования фрагментации. Этот раздел очень важен в современной масс-спектрометрии. Он полезен для исследователей, работающих с любыми химическими соединениями и биополимерами. Несколько глав посвящены идентификации белков и пептидов. Сюда входят варианты автоматизированной идентификации, расшифровка спектров вручную, описание определенных сложностей масс-спектрометрического секве-нирования и вариантов их преодоления. Рассмотрены достоинства и недостатки двух основных подходов установления химической структуры белков: масс-спектрометрии "сверху-вниз" и "снизу-вверх". Отдельная глава посвящена вопросам количественного анализа.

Книга посвящена Александру Леонидовичу Курцу и Киму Петровичу Бутину, двум друзьям, замечательным профессорам химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, очень близких нам в человеческом отношении, непосредственно участвовавшим в нашем химическом и гуманитарном образовании. Мы всегда высоко оценивали химическую эрудицию и потрясающие личностные качества этих ученых. Именно общение с этими людьми вдохновило нас в самом начале XXI века начать исследования в области масс-спектрометрии пептидов.

А.Т. Лебедев
К.А. Артеменко
Т.Ю. Самгина

высокой способностью хранения, гарантирующей их активное биологическое начало.

ЛИТЕРАТУРА

1. Клычкова Г.Ю. Разработка технологии комплексного препарата из хрящевой ткани кальмара, лосося и осетра // Материа -лы Всерос. Интернет-конф. молодых ученых. - Владивосток: ТИН -РО-Центр, 2004. - С. 164-170.

2. Мецлер Д. Биохимия. Т. 2. - М., 1980. - 605 с.

3. Суховерхова Г.Ю. Биохимическая характеристика хрящевой ткани гидробионтов и технология БАД к пище: Дис. ... канд. техн. наук. - Владивосток, 2006. - 157 с.

4. Сытова М.В. Научное обоснование комплексной переработки амурских осетровых рыб: Автореф. дис. ... канд. техн. наук

М.: ВНИРО, 2005. - 24 с.

Кафедра пищевой биотехнологии

Поступила 07.02.07 г.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВЫХ КОМПОНЕНТОВ КЕРА ТИНОВОГО ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗАТА

Ч.Ю. ШАМХАНОВ, Л.В. АНТИПОВА

Грозненский государственный нефтяной институт Воронежская государственная технологическая академия

Одним из наиболее эффективных способов обработки вторичных ресурсов мясной и птицеперерабатывающей промышленности является применение методов современной биотехнологии для получения пищевых гидролизатов . Функционально-технологические свойства полученных продуктов зависят от биохимического состава и молекулярной массы его белковых компонентов.

При использовании физико-химических методов для определения молекулярной массы белков результат зависит не только от массы, но и от электрического заряда и формы молекулы белка, особенно при изменении скорости диффузии белка, скорости седиментации в гравитационном поле . В связи с этим при определении молекулярных масс белков предпочтительнее использовать статистические методы, когда белковый раствор находится в состоянии равновесия, например, при пропускании его через колонку, заполненную гелем .

Цель работы - определение молекулярной массы М белковых компонентов кератинового ферментативного гидролизата и его биохимического состава.

Для определения молекулярной массы белковых компонентов кератинового гидролизата применяли метод гель-фильтрации . Использовали сефадекс в-100 (средний, диаметр частиц 40-120 мкм) с пределами фракционирования 4000-150000 Да.

Колонку размерами 46,0 х 1,9 см заполняли сефа-дексом, обработанным 0,02 М универсальным буфером с рН 7,0. Наносили на нее 1,5 см3 раствора -7 мг/см3 - кератинового гидролизата и элюировали тем же универсальным буфером со скоростью 12 см3/ч. Собирали фракции по 3 см3 и затем определяли в них содержание белка спектрофотометрически на СФ-46 при 280 нм. Для определения молекулярной массы фракций кератинового гидролизата колонку с сефадексом предварительно проградуировали в тех же условиях при помощи нескольких чистых (маркерных) белков с известной М. Калибровочную кривую строили, используя линейную зависимость между ^ М и объемом

элюата Уе, вышедшего с колонки. В табл. 1 представлены некоторые физико-химические характеристики маркерных белков.

Таблица 1

Маркерный белок М, Да 1§ м V, см3

Лизоцим 13930 4,143 54

Трипсин 25700 4,409 48

Пероксидаза 34000 4,531 45

Бычий альбумин 68000 4,832 36

Голубой декстран 2000000 6,301 21

Водорастворимая фракция

керопептида <10000 2,845 72

Водорастворимая фракция кератинового гидролизата выходит с колонки в значительно меньшем объеме, чем маркерный белок лизоцим с наименьшей молекулярной массой. Следовательно, в кератиновом гидролизате (керопептиде) отсутствуют белковые фракции с М > 13930 Да. Ориентировочная масса продуктов гидролиза находится ниже уровня 10000 Да, определяемого методом гель-фильтрации на сефадексе в-100 маркерными белками. Линейная зависимость между ^ М белков и объемом элюата Уе, вышедшего с колонки, представлена на рис. 1 (1 - голубой декстран; 2 - бычий альбумин; 3 - пероксидаза; 4 - трипсин; 5 -лизоцим; 6 - водорастворимая фракция керопептида).

В связи с отсутствием маркерных белков в исследуемом диапазоне 10000-5000 Да поиск фракции водорастворимого белка осуществляли при помощи порис-

Таблица 2

М, Да Растворимый белок и пептиды, мг/см3 Суммарные пептиды и аминокислоты, мкг/см3 Тирозин, мкмоль/см3 Редуцирующие вещества, мкг/см3

0-10000 5,64 7337 7,835 2815

0-5000 4,21 5278 5,960 2272

% от исходной 74,6 71,9 76,1 80,7

тых мембран марок УПМ-100 и УАМ-50 на лабораторной ультрафильтрационной установке (ЗАО НПО «Техкон»). Схема включала саму установку с 5%-м раствором керопептида, помещенную для его постоянного перемешивания на магнитную мешалку. Для эффективного разделения белкового раствора в верхнюю часть установки под давлением подавали сжатый воздух Продукты гидролиза проходили через пористые мембраны, поочередно сменяемые в зависимости от желаемой молекулярной массы ультрафильтрата, в нижнюю часть установки и собирались в приемную емкость. В полученных ультрафильтратах определяли ряд биохимических показателей, позволяющих оценить распределение продуктов гидролиза по молекулярной массе (табл. 2).

В керопептиде присутствуют низкомолекулярные белки с М 5000-10000 Да. Их массовая доля оценивается как разница в показаниях для фракций 0-10000 и 0-5000 Да и составляет 1,43 мг/см3. Эта фракция дала также положительную реакцию на нингидриновую реакцию (2059 мкг/см3), тирозин (1,875 мкмоль/см3) и редуцирующие вещества (543 мкг/см3). Однако основная доля продуктов гидролиза сосредоточена в более низкомолекулярной фракции с М < 5000 Да, соответствующей по существующей классификации фракции пептидов. Массовая доля всех исследуемых показателей составляет более 7 0% от аналогичных значений во фракции 0-10000 Да.

Дальнейшее определение молекулярной массы водорастворимых белковых фракций керопептида проводили на сефадексе в-25 (средний, диаметр частиц 50-150 мкм), позволяющем устанавливать ее в пределах фракционирования 1000-5000 Да. Условия проведения гель-фильтрации оставались неизменными. По

результатам определения белка во фракциях строили профиль элюции. Во всех фракциях помимо белка определяли содержание низкомолекулярных веществ нингидриновым методом, тирозина и редуцирующих веществ (РВ), а также устанавливали количественное распределение белковых фракций. На рис. 2 представлена гель-хроматограмма ферментативного кератино-вого гидролизата через сефадекс в-25 (кривая 1 - белок; 2 - нингидриновая проба; 3 - тирозин; 4 - РВ).

В этом случае белок обнаруживается в виде двух небольших пиков практически в первых же фракциях. Массовая доля белка во фракциях № 1-8 с 3-24 см3

имеет достаточно высокие значения и составляет 0,12-0,18 мг/см3 (кривая 1).

Основная масса продукта выходила с колонки в виде максимального пика белка объемом 27 см3 элюата (фракция № 9, по 3 см3 элюата). Массовая доля белка в этой фракции зарегистрирована на уровне 0,66 мг/см3, что в 3-4 раза выше, чем в остальных исследуемых фракциях.

Дальнейшая элюция керопептида в диапазоне объемов 36-96 см3 выявила три пика с понижением в них массовой доли белка не более 0,08 мг/см3. Полностью раствор керопептида элюируется в конечном объеме 96 см3.

Во фракции № 9 обнаружено все количество имеющихся в наличии РВ массовой долей 66 мкг/см3 (кривая 4). Нингидриновую реакцию применяли при гель-хроматографии для идентификации распределения продуктов гидролиза по молекулярной массе. Установлено, что при взаимодействии избыточного количества нингидрина и белковых продуктов со свободной МН2-группой и в зависимости от количества этих групп можно определить местонахождение белковых

РВ, мкг/см3 175 со Г 5 о л с; ,7 0,

100 125 X - 3 со о о. 0,5

80 § 100 2 _ н 0,4

60 1 изин, 7 сл 0,3

40 1 л 5 о - (П 2 о I- 0,2

20 25 _ 2 ай О 0,1

6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 V, см

производных при элюции через сефадекс. Так, низкая массовая доля нингидрина (4-6 мкг/см3) весьма точно отражает количество свободных аминогрупп и определяет нахождение высокомолекулярных пептидов с М 3000-5000 Да во фракциях J№ 1-8 (кривая 2). Известно, что в диапазон измерения молекулярной массы продуктов гидролиза < 5000 Да входят только пептиды и аминокислоты. При больших концентрациях белка (фракция № 9) соответственно увеличивается окрашивание его свободных аминогрупп нингидрином -64 мкг/см3. Этот диапазон элюции характеризует наличие во фракциях № 8-12 среднемолекулярных пептидов с М 300-3000 Да. Определяемый с помощью маркерных белков по калибровочной кривой lg M керопептида 2,845 также указывает на его ориентировочную массу > 700 Да. Дальнейший анализ профиля элю-ции по нингидриновой пробе (фракции № 12-36) выявил пик, не соответствующий его концентрации по белку, как наблюдалось для пептидов в предыдущих фракциях. Массовая доля низкомолекулярных веществ во фракции № 23 составила 157 мкг/см3, что более чем в 2 раза превышает аналогичный показатель для пептидов во фракции № 9. Обратная пропорциональная зависимость показателей белка и нингидрино-вой пробы во фракциях № 9 и 23 указывает по качественному анализу на присутствие в последней фракции продуктов гидролиза в виде свободных аминокислот. Принадлежность к ней и аминокислоты тирозина (0,06 мкмоль/см3) является еще одним доказательством высказанного положения.

Таким образом, гель-фильтрация кератинового гидролизата через сефадексы G-100 и G-25 свидетельствует о наличии в нем низкомолекулярного раствори-

мого белка (< 10000 Да), составляющего 25% от его общего количества в гидролизате. Преобладающая часть белковых продуктов - 75% - представлена среднемолекулярными пептидами (300-3000 Да) с ориентировочной М > 700 Да. В данном случае белковые цепочки содержат 5-20 аминокислотных остатков. Важно подчеркнуть, что фракция № 9 одновременно дает реакции на биуретовую связь, нингидрин, тирозин и РВ. Подобная характеристика предполагает наличие в белке кератине углеводов и их непосредственной связи с белком в составе единого комплекса.

ЛИТЕРАТУРА

1. Антипова Л.В., Пащенко Л.П., Шамханов Ч.Ю., Ку -рилова Е.С. Получение и характеристика пищевого кератинового гидролизата // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2003. - № 7.

2. Антипова Л.В., Шамханов Ч.Ю., Осминин О.С., По -жалова Н.А. Биохимические характеристики процесса ферментативного гидролиза кератинсодержащего сырья птицеперерабаты -вающей отрасли // Изв. вузов. Пищевая технология. - 2003. - № 5-6.

3. Антипова Л.В., Шамханов Ч.Ю., Осминин О.С. Со -

вершенствование технологии производства керопептида из перо-пу -хового сырья // Мясная индустрия. - 2004. - № 3. - С. 44-47.

4. Рогов И.А., Антипова Л.В., Дунченко Н.И., Жереб -цов Н.А. Химия пищи. В 2 кн. Кн. 1. Белки: структура, функции, роль в питании. - М.: Колос, 2000. - 384 с.

5. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М.: Наука, 1985. - 536 с.

6. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимоло-гии. - 2-е изд., перераб. и доп. - М. : Высш. шк., 1980. - 272 с.

Кафедра технологии продуктов питания Кафедра технологии мяса и мясных продуктов

Поступила 0S.02.0? г.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ МЕХАНИЗМА КОНСЕРВИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ КОМПОНЕНТОВ КОПТИЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ

С.В. ЗОЛОТОКОПОВА, И.А. ПАЛАГИНА

Астраханский государственный технический университет Астраханский филиал Саратовского государственного социально-экономического университета

Важным направлением исследований последних лет является изучение влияния различных пищевых добавок не только на вкус и аромат, но и на увеличение сроков хранения продуктов питания. С древних времен для консервирования используют пряные растения, поваренную соль, копчение и др. Анализ показывает, что в настоящее время рынок завоевывают коптильные экстракты. Продукты питания с ароматом копчения пользуются у населения особой популярностью, а традиционное копчение уступает свои позиции бездымному.

Экологически выгодными и перспективными являются экстракты, получаемые при щадящих условиях.

Над усовершенствованием технологии экстракции не одно десятилетие работает Г.И. Касьянов - заслуженный деятель науки и техники РФ, заслуженный изобретатель РФ, доктор технических наук, профессор, заведующий кафедрой технологии мясных и рыбных продуктов Кубанского государственного технологического университета. Действующая при КубГТУ и Краснодарском научно-исследовательском институте хранения и переработки сельскохозяйственной продукции под его руководством научно-педагогическая школа «Теория и практика обработки сырья растительного и животного происхождения сжиженными и сжатыми газами» занимается проблемами повышения эффективности переработки различного сырья, позволяющими улучшить качество выпускаемой продукции, сократить продолжительность процессов обработки и одновременно снизить энергетические затраты.

ГОСТ Р 53761-2009

Группа Н19

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОЛОКО

Идентификация белкового состава электрофоретическим методом в полиакриламидном геле

Milk. Identification of protein composition by use of electrophoresis in polyacrilamide gel

ОКС 67.100.10
ОКСТУ 9209

Дата введения 2011-01-01

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании" , а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Государственным учреждением Ярославской области "Ярославский государственный институт качества сырья и пищевых продуктов" (ГУ ЯО "ЯГИКСПП")

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 470 "Молоко и продукты переработки молока"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 15 декабря 2009 г. N 1271-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на сырое молоко и устанавливает метод идентификации в его составе белков молочного и немолочного происхождения с использованием электрофореза в полиакриламидном геле.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ Р 52054-2003 Молоко коровье сырое. Технические условия

ГОСТ Р 52349-2005 Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины и определения

ГОСТ Р 52738-2007 Молоко и продукты переработки молока. Термины и определения

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 450-77 Кальций хлористый технический. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3769-78 Реактивы. Аммоний сернокислый. Технические условия

ГОСТ 5860-75 Реактивы. Кислота аминоуксусная. Технические условия

ГОСТ 5867-96 Молоко и молочные продукты. Методы определения жира

ГОСТ 6259-75 Реактивы. Глицерин. Технические условия

ГОСТ 6691-77 Реактивы. Карбамид. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 7730-89 Пленка целлюлозная. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13928-84 Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к анализу

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 20478-75 Реактивы. Аммоний надсернокислый. Технические условия

ГОСТ 23932-90 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия

ГОСТ 24104-2001 * Весы лабораторные. Общие технические требования
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008 , здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 27752-88 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия.

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины, установленные нормативными правовыми актами Российской Федерации , ГОСТ Р 52349 , ГОСТ Р 52738 .

4 Сущность метода

Электрофорез - метод разделения веществ, основанный на явлении миграции заряженных молекул под действием внешнего электрического поля.

Находящиеся в буферном растворе (ПААГ геле) макромолекулы белков обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. При пропускании электрического тока вдоль геля, устанавливается определенный градиент напряжения, т.е. формируется электрическое поле. Под действием этого поля макромолекулы белков в соответствии со своим зарядом мигрируют в направлении катода или анода. Исследуемая проба, состоящая из различных молекул, разделяется на зоны молекул с одинаковой молекулярной массой и зарядом, мигрирующих с одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине геля в виде полос и закрепляются.

5 Средства измерения, вспомогательное оборудование, материалы, посуда и реактивы

Ячейка для вертикального электрофореза со следующими параметрами:

- общие размеры ячейки 260х190х300 мм;

- центральный термостатируемый резервуар и адаптер для трубок, изготовленные из формованного полимера;

- нижняя электродная камера и крышка, изготовленные из формованного поликарбоната;

- зажимы, подставка для заливки и эксцентрики, изготовленные из остеклованного и армированного тефлоном поликарбоната;

- электроды, изготовленные из платиновой проволоки диаметром 0,254 мм;

- пластины стеклянные размером: внутренний - 200х200 мм и внешний - 200х225 мм;

- предельное значение напряжения 1000 В.

Источник напряжения с диапазоном регулируемого напряжения (20-5000) В, силой тока (0,01-500) мА и мощностью (0,1-400) Вт.

Компьютер с характеристиками не ниже: /Celeron 600/250 mb/HDD 4Gb/CD-ROM/ видеокарта 4 Mb.

Монитор цветной с минимальными требованиями: разрешение экрана 1024x768, качество цветопередачи 16-бит.

Фотоаппарат цифровой с минимальными требованиями: разрешающая способность 1024x768, матрица - 1,3 млн. пикселей.

Анализатор потенциометрический с диапазоном измерения (0-12) ед. рН, с ценой деления 0,1 ед. рН.

Весы лабораторные 1-го класса точности (специальные) по ГОСТ 24104 с пределами абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0,0003 г.

Термометр лабораторный шкальный от 0 °С до 100 °С с ценой деления 1 °С по ГОСТ 28498 .

Аппарат для встряхивания типа "Вортекс" (скорость вращения 250-3000 об/мин).

Термостат твердотельный типа "Гном" под пробирки типа "Эппендорф" вместимостью 1,5 см с диапазоном рабочих температур от окружающей до 99 °С.

Холодильник бытовой электрический любого типа, обеспечивающий поддержание температуры в холодильной камере (4±2) °С по ГОСТ 16317 .

Плитка электрическая бытовая с регулируемым обогревом любого типа по ГОСТ 14919 .

Электросепаратор бытовой, обеспечивающий получение обезжиренного молока с массовой долей жира не более 0,05%.

Часы 2-го класса точности по ГОСТ 27752 .

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 .

Центрифуга лабораторная с частотой вращения не менее 5000 об/мин.

Микроцентрифуга настольная типа "Эппендорф" (частота вращения не менее 13000 об/мин).

Мешалка магнитная с регулируемым электрообогревом любого типа.

Баня водяная, обеспечивающая нагрев до температуры 50 °С.

Пипетдозаторы одноканальные переменного объема:

- рабочий объем 0,002-0,02 см, шаг переменного объема 0,001 см;

- рабочий объем 0,02-0,2 см, шаг переменного объема 0,01 см;

- рабочий объем 0,2-1 см, шаг переменного объема 0,1 см.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026 .

Пленка целлюлозная по ГОСТ 7730 .

Воронка В-75-80 ХС по ГОСТ 25336 .

Колбы исполнения 2-50-2, 2-100-2, 2-500-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770 .

Колбы исполнения 1-100, Кн-1-50-14/23 ХС, Кн-1-100-29/32 ХС, Кн-1-250-24/29 ХС, Кн-1-500-29/32 ХС, Кн-1-2000-29/32 ХС по ГОСТ 25336 .

Цилиндры исполнения 1-50-2, 1-100-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770 .

Эксикатор по ГОСТ 23932 .

Пипетка исполнения 1-1-2-10, 1-1-2-25 по ГОСТ 29227 .

Насос водоструйный по ГОСТ 25336 .

Микрошприц вместимостью 0,05 см.

Пробирки микроцентрифужные типа "Эппендорф" вместимостью 1,5 см.

Стакан исполнения В-1-50 ХС, В-1-100 ХС, В-1-250 ХС по ГОСТ 25336 .

Наконечники для дозаторов с переменным объемом 0,02, 0,2 и 1 см.

Акриламид (массовая доля основного вещества не менее 99,9%).

N",N"-Метиленбисакриламид, для электрофореза.

Трис-(гидроксиметил)-аминометан (массовая доля основного вещества не менее 99,8%).

Карбамид, ч.д.а., по ГОСТ 6691 .

Кумасси бриллиантовый голубой G-250, для электрофореза.

Кислота аминоуксусная, х.ч., по ГОСТ 5860 .

Бромфеноловый синий, для электрофореза.

Аммоний надсернокислый, х.ч., по ГОСТ 20478 .

N,N,N",N"-Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), для электрофореза.

Ацетон, х.ч., по ГОСТ 2603 .

Глицерин, ч.д.а., по ГОСТ 6259 .

Эфир диэтиловый, ч.д.а., по .

Кислота соляная, х.ч., по ГОСТ 3118 .

Аммоний сернокислый, х.ч., по ГОСТ 3769 .

Спирт этиловый по ГОСТ Р 51652 .

Кислота уксусная ледяная, х.ч., по ГОСТ 61 .

Кальций хлористый безводный по ГОСТ 450 .

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 .

Допускается применять другие средства измерений, вспомогательные устройства и реактивы с метрологическими или техническими характеристиками не хуже указанных.

6 Отбор проб для анализа

Основные понятия и общие правила отбора проб - по ГОСТ 13928 и ГОСТ 26809 .

Пробы транспортируют при температуре от 2 °С до 8 °С не более 12 ч.

В случае, если анализ не может быть проведен сразу, пробы рекомендуется хранить в холодильнике при температуре (4±2) °С не более 24 ч.

Не допускается консервирование проб.

7 Подготовка к проведению анализа

7.1 Приготовление растворов

7.1.1 Раствор соляной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм

В мерную колбу вместимостью 1000 см вносят около 500 см дистиллированной воды и 90 см концентрированной соляной кислоты плотностью 1,174 г/см (или 85 см концентрированной соляной кислоты плотностью 1,188 г/см), аккуратно перемешивают и доводят полученный объем дистиллированной водой до метки.

Срок хранения раствора - 3 мес.

7.1.2 Раствор карбамида молярной концентрацией 6 моль/дм

В химическом стакане вместимостью 50 см растворяют (18,02±0,01) г карбамида в 30 см дистиллированной воды, переливают в мерную колбу вместимостью 50 см и доводят полученный объем дистиллированной водой до метки.

7.1.3 Раствор лидирующего красителя

В микроцентрифужную пробирку типа "Эппендорф" вместимостью 1,5 см помещают (0,0040±0,0003) г бромфенолового синего, добавляют 1 см дистиллированной воды и перемешивают на аппарате для встряхивания типа "Вортекс" (до полного растворения красителя).

Срок хранения раствора при температуре (4±2) °С - 1 мес.

7.1.4 Раствор трис-НСl

В химическом стакане вместимостью 100 см растворяют (6,070±0,001) г трис-(гидрооксиметил) аминометана в 50 см дистиллированной воды, доводят раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм до (8,8±0,1) ед. рН, переливают в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят до метки.

7.1.5 Раствор мономеров полиакриламидного геля

В коническую колбу вместимостью 50 см вносят (3,1040±0,0003) г акриламида, (0,0960±0,0003) г N",N"-метиленбисакриламида, (3,1040±0,0003) г карбамида, добавляют 8,75 см раствора трис-НСl, приготовленного по 7.1.4 и 26 см дистиллированной воды. Перемешивают на магнитной мешалке с электроподогревом при температуре (50±5) °С в течение 30 мин и охлаждают до комнатной температуры.

Срок хранения раствора в стеклянной колбе с притертой пробкой при температуре (4±2) °С - 1 мес.

Примечание - Количество раствора для полиакриламидного геля дано для одного анализа и получения геля размером (160х160х1) мм.

7.1.6 Раствор электродного буфера

В мерную колбу вместимостью 500 см вносят (4,50±0,01) г трис-(гидрооксиметил) аминометана, (21,60±0,01) г аминоуксусной кислоты и растворяют в 300 см дистиллированной воды, полученный объем доводят до метки, переливают в коническую колбу вместимостью 2000 см и добавляют 1000 см дистиллированной воды.

Срок хранения раствора в стеклянной колбе с притертой пробкой при температуре (4±2) °С - 1 мес.

Примечание - Количество электродного буфера одного анализа дано для одной электрофоретической ячейки с параметрами, указанными в разделе 5. При использовании электрофоретической ячейки другого типа количество электродного буфера должно быть соответственно скорректировано.

7.1.7 Раствор для окрашивания геля

В коническую колбу вместимостью 500 см вносят (0,50±0,01) г кумасси бриллиантового голубого, добавляют 200 см этилового спирта, 50 см кислоты уксусной ледяной и 250 см дистиллированной воды. Содержимое колбы тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора в стеклянной колбе с притертой пробкой при температуре (4±2) °С - 1 мес.

7.2 Подготовка контрольных проб

Для приготовления контрольных проб используют сырое молоко по ГОСТ Р 52054 и с кислотностью (16,0-20,0) °Т без содержания консервантов и ингибирующих веществ.

7.2.1 Отделение жира

7.2.1.1 Метод сепарирования

(0,4-0,5) дм молока перед сепарированием подогревают на водяной бане до температуры (40-45) °С.

Через 1-2 мин после включения электропривода сепаратора для прогрева молочного тракта через электросепаратор пропускают 1 дм дистиллированной воды, нагретой до температуры (40-50) °С. Далее, не выключая электропривод сепаратора, заливают предварительно подогретое молоко и сепарируют. После сепарирования обезжиренное молоко используют для дальнейшего анализа.

7.2.1.2 Метод центрифугирования

(0,4-0,5) дм молока помещают в центрифужные пробирки или стаканы и центрифугируют при 5000 об/мин в течение (20-30) мин. После центрифугирования центрифужные пробирки (стаканы) помещают в холодильник и охлаждают при температуре (4±2) °С. После полного охлаждения застывший верхний жировой слой удаляют, а оставшееся обезжиренное молоко используют для дальнейшего анализа.

7.2.2 Выделение белков

В химический стакан вместимостью 250 см вносят 50 см предварительно обезжиренного молока (с массовой долей жира не более 0,05% по ГОСТ 5867-90), нагревают на водяной бане до температуры (35-40) °С и осаждают казеин, прибавляя по каплям раствор соляной кислоты, приготовленный по 7.1.1. Осадку дают отстояться, сыворотку осторожно сливают. Осадок промывают, добавляя 50 см дистиллированной воды, перемешивают, дают отстояться и сливают воду. Промывку проводят не менее пяти раз.

К отмытому осадку добавляют 30 см ацетона и оставляют на 30 мин, затем ацетон осторожно сливают. Действие повторяют до полного удаления жира, но не менее пяти раз. Осадок фильтруют через сухой складчатый фильтр и переносят в коническую колбу вместимостью 250 см, заливают 120 см диэтилового эфира и закрывают притертой пробкой. Перемешивают не менее 5 мин и оставляют на 12 ч в холодильнике. Через 12 ч осадок фильтруют через сухой складчатый фильтр и подсушивают на воздухе в вытяжном шкафу не менее 1 часа.

(10,0±0,1) г подсушенной пробы переносят в коническую колбу вместимостью 100 см, добавляют 60 см раствора карбамида, приготовленного по 7.1.2, перемешивают на магнитной мешалке при температуре (50±5) °С до полного растворения белка. Получившийся раствор переносят в мешочек для диализа, изготовленный из целлофановой пленки, который погружают в дистиллированную воду и помещают в холодильник. Диализ (освобождение раствора от низкомолекулярных соединений) проводят не менее 24 ч при периодической смене дистиллированной воды. После чего образовавшийся осадок фильтруют через сухой складчатый фильтр и высушивают в эксикаторе над безводным хлористым кальцием не менее 4 часов.

Срок хранения выделенного казеина при температуре (4±2) °С - не более 2-х недель.

Сыворотку, оставшуюся после выделения казеина, сливают в коническую колбу вместимостью 250 см и добавляют аммоний сернокислый (на 25 см сыворотки (17,5±0,1) г аммония сернокислого), и тщательно перемешивают до полного растворения. Помещают в холодильник при температуре (4±2) °С на 12 ч. Отделившийся белок фильтруют через сухой складчатый фильтр и переносят в мешочек для диализа, изготовленный из целлофановой пленки, который погружают в дистиллированную воду и помещают в холодильник. Диализ проводят не менее 24 ч при периодической смене дистиллированной воды. Через 24 ч образовавшийся осадок фильтруют через сухой складчатый фильтр и высушивают в эксикаторе над безводным хлористым кальцием не менее 4 ч.

Срок хранения сывороточных белков при температуре (4±2) °С - не более 2-х недель.

7.3 Подготовка исследуемых проб молока

Отделение жира и выделение белков исследуемых проб молока осуществляется по 7.2.1 и 7.2.2.

7.4 Приготовление растворов белков

7.4.1 Приготовление контрольных растворов белков

В микроцентрифужную пробирку типа "Эппендорф" вместимостью 1,5 см помещают (0,0040±0,0003) г белка, выделенного по 7.2, 7.3, добавляют 0,5 см раствора карбамида, приготовленного по 7.1.2, выдерживают в термостате при температуре 95 °С в течение 5 мин, тщательно перемешивают на аппарате для встряхивания типа "Вортекс" до полного растворения белков. К полученному раствору добавляют 0,2 см глицерина и 0,025 см лидирующего красителя, приготовленного по 7.1.3, тщательно перемешивают на аппарате для встряхивания типа "Вортекс", центрифугируют при частоте 3000 об/мин в течение 5 мин, образовавшийся осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость используют для анализа.

Срок хранения растворов белков при температуре (4±2) °С - не более семи суток.

7.4.2 Приготовление исследуемых растворов белков

Приготовление исследуемых растворов белков осуществляется по 7.4.1.

8 Условия проведения анализа

При выполнении анализа должны соблюдаться следующие условия:


	Температура окружающего воздуха
	Относительная влажность воздуха	от 30% до 80%
	Атмосферное давление	от 84 до 106 кПа
	Напряжение в сети
	Частота переменного тока

9 Проведение анализа

При сборке камеры для полимеризации геля используют стеклянные пластины размером: внутренняя - (200х200) мм и внешняя - (200х225) мм.

На внешнюю пластину справа и слева вдоль длинных сторон помещают спейсеры (пластинки) толщиной 1 мм. Поверх спейсеров накладывают внутреннюю стеклянную пластину. Пластины фиксируют зажимами справа и слева и устанавливают на подставку для заливки с желобом для выравнивания. Камеру проверяют на герметичность с помощью дистиллированной воды, которую затем удаляют. После проверки камеры на герметичность между пластинами камеры под небольшим углом помещают гребенку для формирования лунок.

Для обеспечения нормального процесса полимеризации геля раствор мономеров, приготовленный по 7.1.5, подвергают деаэрации в колбе с тубусом, присоединенной к водоструйному насосу. После деаэрации в раствор добавляют (0,0180±0,0003) г аммония надсернокислого и 0,018 см N,N,N",N"-тетраметилэтилендиамина, осторожно перемешивают для предотвращения образования пузырей в растворе. Стеклянной пипеткой с грушей вдоль края спейсера (с приподнятой стороны гребенки) раствор вносят в камеру для полимеризации.

Гель полимеризуется в течение 45 мин, после чего гребенку извлекают и ополаскивают образовавшиеся в геле лунки дистиллированной водой.

Камеру с гелем прикрепляют к термостатируемой части и помещают в электрофоретическую ячейку.

В электродные камеры ячейки заливают электродный буфер, приготовленный по 7.1.6.

В лунки геля под электродный буфер с помощью микрошприца вносят контрольные и исследуемые растворы белков, приготовленные по 7.4. Крайние лунки геля рекомендуется использовать для контрольных растворов белков. Количество раствора, вносимого в одну лунку, составляет (0,020-0,025) см. После каждого внесения микрошприц тщательно промывают раствором электродного буфера.

Для получения достоверных результатов рекомендуется каждый исследуемый раствор белка вносить не менее чем в трех повторностях.

После внесения контрольных и исследуемых растворов электрофоретическую ячейку закрывают крышкой.

Электрофорез проводят в течении (4-5) ч в режиме постоянного напряжения (120-130) В.

Примечание - Режим указан для электрофоретической ячейки с параметрами, указанными в 5, и полиакриламидного геля размером (160х160х1) мм. При использовании ячейки другого типа или геля с другими размерами режим проведения электрофореза подбирается индивидуально.

Для предотвращения неравномерного распределения тепла и искажения белковых зон (полос) рекомендуется обеспечить принудительное охлаждение термостатируемого резервуара.

Электрофорез считают законченным, когда лидирующий краситель опустится до нижнего края геля.

После проведения электрофореза гель аккуратно извлекают из электрофоретической ячейки, фиксируют и окрашивают. Фиксация и окраска осуществляются одновременно в растворе, приготовленном в соответствии с 7.1.7, в течение 2 ч. Для ускорения процесса допускается проводить окрашивание и фиксацию геля в течение одного часа на электроплитке при (40±5) °С, а ванночку с раствором и гелем необходимо регулярно покачивать.

Отмывку окрашенного геля производят кипячением в 10%-ном растворе уксусной кислоты до полного удаления фона с постоянной сменой отмывающего раствора по мере вымывания краски.

В приложении А приведены возможные причины отклонения от стандартного хода анализа и предложены способы их устранения.

Визуализацию разделения белков после электрофореза осуществляют с помощью фотоаппарата. Полученные электрофореграммы сохраняют на жестком магнитном носителе компьютера.

10 Интерпретация результатов анализа

Идентификацию белков молочного и немолочного происхождения осуществляют визуально.

Совпадение белковых фракций (полос) на электрофореграмме контрольного и исследуемых растворов (не менее чем в трех повторностях) указывает на отсутствие в составе продукта белков немолочного происхождения (рисунок 1).

Рисунок 1 - Электрофореграмма раствора белков исследуемой пробы, в составе которой отсутствуют белки немолочного происхождения

При наличии в исследуемой пробе белков немолочного происхождения на электрофореграмме присутствуют дополнительные белковые фракции (полосы), которые не наблюдаются в контрольных пробах (рисунок 2).

Рисунок 2 - Электрофореграмма раствора белков исследуемой пробы, в составе которой присутствует белок немолочного происхождения

В случае возникновения сомнений о наличии в исследуемой пробе белков немолочного происхождения (слабое изображение отдельных фракций) рекомендуется увеличить концентрацию белков в пробе и повторить анализ.

11 Требования, обеспечивающие безопасность

При проведении электрофоретического анализа необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007 , требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации и инструкции по эксплуатации ячейки для электрофореза.

Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009 . Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать допустимых значений по ГОСТ 12.1.005 .

При работе с нейротоксинами следует соблюдать особую осторожность, все манипуляции обязательно проводить в резиновых перчатках и только в вытяжном шкафу.

К выполнению анализа и обработке результатов допускают специалиста, имеющего высшее или среднее специальное биохимическое образование, или опыт работы в биохимической лаборатории, прошедшего соответствующий инструктаж и освоившего метод в процессе обучения.

Приложение А (справочное). Причины отклонения от стандартного хода анализа и способы их устранения

Приложение А
(справочное)

Таблица А.1


Отклонение	Возможные причины	Способы устранения
1 Полосы по краям геля расположены выше, чем в центре	Центральная часть геля нагревается сильнее краев	Центральный резервуар заполнить охлаждающим раствором
	Избыточное напряжение	Охлаждающий раствор прокачивать при температуре (10-15) °С; уменьшить напряжение
2 Диффузия лидирующего красителя	Распад раствора белков пробы и/или растворов буферов	Приготовить растворы из свежих реактивов
	Диффузия	Если полосы белка имеют такой же диффузный характер, как и полоса лидирующего красителя, увеличить: силу тока на (25-50)%
3 Вертикальная исчерченность трека	Избыточная концентрация белков в пробе	Уменьшить концентрацию белков в пробе; уменьшить напряжение на 25%
4 Горизонтальная исчерченность трека	Неполное растворение белков	Полностью растворить пробу; центрифугировать
5 Широкие или размытые полосы или пятна белков	Диффузия в связи с медленной миграцией	Увеличить силу тока на 20%
	Химические модификации ионными загрязнениями	Деионизовать раствор карбомида
	Неполное обезжиривание пробы	Полностью удалить жир
6 Размывание полос в латеральном направлении	Диффузия растворов белков за пределы лунок до включения напряжения	Уменьшить время между внесением пробы и подачей напряжения
7 Искривленные полосы	Недостаточная полимеризация геля вокруг лунок	Дегазировать раствор мономеров геля; увеличить концентрации аммония надсернокислого и N,N,N",N"-тетраметилэтилендиамина на 25%
	Наличие солей в пробе	Удалить соли диализом
	Неровная поверхность геля	Проверить стадию взятия проб для приготовления геля, при необходимости заменить реактивы
8 Электрофорез занимает более 5 ч	Высокая концентрация электродного буфера	Проверить стадию приготовления электродного буфера (при необходимости разбавить буфер), проверить качество дистиллированной воды, заменить реактивы
	Низкое напряжение	Увеличить напряжение на (25-50)%
9 Электрофорез идет слишком быстро с плохим разрешением	Буфер слишком разбавлен	Проверить стадию приготовления электродного буфера, проверить качество дистиллированной воды, заменить реактивы
	Слишком высокое напряжение	Уменьшить напряжение на (25-50)%
10 Наблюдается несовпадение полос в контрольных пробах	Часть белка могла окислиться во время электрофореза или не была полностью восстановлена на стадии подготовки пробы	Приготовить свежие контрольные пробы; заменить реактивы

Библиография

Федеральный закон Российской Федерации от 12 июня 2008 г. N 88-ФЗ "Технический регламент на молоко и молочную продукцию"

ТУ 2600-001-43852015-05 Эфир диэтиловый

Электронный текст документа

подготовлен АО "Кодекс" и сверен по:
официальное издание
М.: Стандартинформ, 2010

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Масс-спектрометрия в протеомике.

2.1.1 Общие принципы.

2.1.2 Протеомный анализ с использованием масс-спектрометрии.

2.1.3 Идентификация белков методом отпечатков пептидных масс.

2.1.4 Идентификация белков методом отпечатков фрагментации пептидов.

2.2 Интерпретация результатов масс-спектрометрической идентификации белков.

2.2.1 Определение списка идентифицированных белков.

2.2.2 Идентификация высокогомологичных белков.

2.2.3 Базы данных аминокислотных последовательностей белков.

2.3 Масс-спектрометрический анализ продуктов одного гена.

2.3.1 Протеотипирование и популяционная протеомика.

2.3.2 Идентификация микрогетерогенности белков методом «сверху-вниз».

2.3.3 Идентификация генетически-детерминированного полиморфизма белков методом «снизу-вверх».

2.3.4 Базы данных полиморфизмов белков и генов.

2.3.5 Репозитории масс-спектрометрических данных.

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Материалы.

3.1.1 Масс-спектрометрические данные для белков микросомальной фракции печени человека.

3.1.2 Контрольный набор масс-спектров «Aurum Dataset».

3.1.3 Масс-спектрометрические данные протеомного репозитория PRIDE.

3.1.4 Базы данных аминокислотных последовательностей белков человека.

3.1.5 Данные о возможных полиморфизмах белков человека.

3.2 Методы.

3.2.1 Веб-сервер идентификации белков по масс-спектрам.

3.2.2 Пакетная обработка масс-спектров методом отпечатков пептидных масс.

3.2.3 Пакетная обработка тандемных масс-спектров.

3.2.4 Одномерное протеомное картирование.

3.2.5 Программная реализация итеративного алгоритма идентификации ОАП.

3.2.6 Валидация алгоритма идентификации ОАП.

4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Увеличение степени покрытия аминокислотных последовательностей идентифицированными пептидами.

4.1.1 Идентификация белков в срезах геля.

4.1.2 Одномерные протеомные карты и их свойства.

4.1.3 Выявление высокогомологичных белков надсемейства цитохромов Р450 за счет увеличения степени покрытия аминокислотных последовательностей идентифицированными пептидами.

4.2 Идентификация ОАП в белках надсемейства цитохромов Р450.

4.3 Алгоритм идентификации ОАП.

4.3.1 Итеративная схема обработки тандемных масс-спектров.

4.3.2 Чувствительность и специфичность алгоритма идентификации ОАП.

4.4 Применение итеративного алгоритма для выявления ОАП в масс-спектрометрических данных протеомного репозитория PRIDE.

4.4.1 Исходные данные, используемые для выявления ОАП.

4.4.2 Идентификация пептидов и белков с использованием масс-спектрометрических данных, загруженных из репозитория PRIDE.

4.4.3 Идентификация одноаминокислотных полиморфизмов.

4.5 Анализ идентифицированных ОАП.

4.5.1 Анализ ОАП-содержащих пептидов.

4.5.2 Связь выявленных ОАП с заболеваниями человека.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ масс-спектров пептидных фрагментов для идентификации генетически детерминированного полиморфизма белков»

В базе данных Ensembl содержатся сведения о 20 469 кодирующих генов, полученные на основе результатов сборки генома человека, выполненной в Национальном центре биотехнологической информации США (февраль 2009). Небольшое число генов позволяет заключить, что сложность живых систем достигается на уровне регуляции транскрипции, трансляции, и пост-трансляционных модификаций. Альтернативный сплайсинг и такие модификации, как фосфорилирование, гликозилирование, наряду с протеолитическим процессингом, приводят к формированию многообразия белков, количество которых на несколько порядков превышает количество генов. Проведенные различными методами оценки показывают, что протеом человека может насчитывать несколько миллионов различающихся по своему химическому строению белков .

Традиционный подход к исследованию протеома основан на использовании иммуногистохимического окрашивания тканевых срезов. Первый вариант протеомного атласа человека пыл построен с применением антител . Использование биологических микрочипов, содержащих нанесенные на них антитела, позволяет идентифицировать и количественно измерить до нескольких сотен белков в одном образце . Однако данный подход имеет ограничения, которые связаны с необходимостью наработки и верификации антител, недостаточной специфичностью за счет перекрестных взаимодействий и относительно низкой аффинностью комплексов антиген-антитело. В связи с этим особую важность для исследования протеома приобрел более универсальный и не требующий иммуноспецифичных реагентов метод идентификации белков - биологическая масс-спектрометрия .

При масс-спектрометрическом анализе биоматериала идентификация белковых молекул осуществляется путем сопоставления измеренных масс-зарядных характеристик белков и/или их протеолитических фрагментов с теоретическими значениями, вычисленными на основании закодированных в геноме аминокислотных последовательностей. Необходимо учитывать, что в последовательности генома в явном виде не содержится информации о сайтах альтернативного сплайсинга и о возможных пост-трансляционных модификациях. Выявление случаев альтернативного сплайсинга возможно на основании экспериментальных данных: источником сведения о сплайс-изоформах являются базы данных кодирующих ДНК . Выявление посттрансляционных модификаций осуществляется с использованием высокоточной масс-спектрометрии белков или с применением тандемной масс-спектрометрии пептидных фрагментов

Наряду с альтернативным сплайсингом и пост-трансляционной модификацией, разнообразие белковых молекул увеличивается за счет трансляции несинонимичных однонуклеотидных полиморфизмов (non-synonymous Single Nucleotide Polymorphism, nsSNP). Установление наличия nsSNP производится с использованием генотипирования, тогда как подтверждение наличия соответствующей замены остатка в первичной структуре белка, то есть выявление одноаминокислотных полиморфизмов (ОАП, Single Amino Acid Polymorphism, SAP), относится к задачам протеотипирования .

Важность идентификации и исследования на белковом уровне альтернативного сплайсинга, ОАП и пост-трансляционных модификаций обусловлена влиянием данных процессов на уровень экспрессии и функциональные свойства белков. Известно, что изменение активности или уровня экспрессии белков может приводить к возникновению и развитию социально-значимых заболеваний, включая онкологические , сердечно-сосудистые и нейродегенеративные заболевания.

В геноме установлено наличие около 65 тысяч несинонимичных полиморфизмов, предположительно транслируемых в ОАП, причем более 30% предположительно приводят к изменению функциональных свойств белков . Поскольку изменение активности белков связано с развитием заболеваний, то исследования ОАП необходимы для определения структурных причин, лежащих в основе наблюдаемых функциональных нарушений . В задачи протеотипирования входит качественное и количественное определение экспрессии аллельных вариантов генов на протеомном уровне , а также мониторинг частоты встречаемости экспрессируемых аллельных вариантов белков на популяционном уровне .

Идентификация ОАП в высокопроизводительном режиме с использованием масс-спектрометрии сопряжена с техническими ограничениями. Для задачи протеотипирования наиболее адекватным является подход «сверху-вниз», то есть масс-спектрометрия интактных белков (а не их фрагментов). Однако, чувствительность такого подхода невелика, на уровне 10ч-10 5 М. Как следствие, обеспечивается идентификация десятков, реже сотен, и, только в исключительных случаях до тысячи белков. Наиболее часто в биологической масс-спектрометрии применяют другой подход - «снизу-вверх», в котором наличие в образце белка устанавливается путем идентификации его протеолитических фрагментов (пептидов) . В большинстве случаев для идентификации белка достаточно небольшого количества пептидов, которые в совокупности могут составлять не более 5% последовательности биополимера. Для оставшейся части аминокислотной последовательности белка невозможно установить наличие/отсутствие химических модификаций аминокислотных остатков или аминокислотных полиморфизмов.

Для идентификации одноаминокислотных полиморфизмов белков человека с использованием биологической масс-спектрометрии необходимо повысить степень покрытия аминокислотной последовательности белка за счет выявления дополнительных протеолитических пептидов белка. Это возможно в результате проведения эксперимента с большим числом частично или полностью повторяющихся масс-спектрометрических анализов . Кроме того, в рамках одного исследования можно объединять данные протеомных экспериментов, выполненных множеством исследовательских групп. Доступ к обширной коллекции масс-спектров предоставляется различными протеомными репозиториями , в наиболее популярном из которых - PRIDE (Protein Identification Database) -хранятся результаты более 13 тысяч протеомных экспериментов. Чем выше окажется степень покрытия аминокислотной последовательности белка идентифицированными пептидами, тем больше вероятность подтвердить наличие или отсутствие одноаминокислотных замен в структуре белка.

При наличии обширного объема масс-спектрометрических данных решение задачи протеотипирования возможно за счет использования вычислительных методов биоинформатики. Например, анализ масс-спектрометрических данных может осуществляться с использованием баз данных экспрессируемых фрагментов (EST), в которых содержится информация о транслированных вариантах несинонимичных полиморфизма генов . Второй способ, реализованный во многих программах идентификации белков, представляет собой сравнение масс-спектров с базой данных теоретических последовательностей белков, допускающий наличие неточностей в виде замен аминокислотных остатков .

Недостатки указанных выше подходов хорошо известны . В базах данных экспрессируемых фрагментов содержится избыточная информация, включая ошибки секвенирования, что усложняет анализ результатов масс-спектрометрического исследования . Анализируя образец, в котором идентифицировано несколько сотен белков, полученные масс-спектры необходимо сопоставлять с накопленными за десятки лет сотнями тысяч транскриптов, в числе которых содержится более 5% ошибок . При анализе масс-спектров с допущением возможных неточностей в базе данных, игнорируется информация о реально существующих несинонимичных заменах, которые были установлены генотипированием. Искусственные допущения, введенные в базу данных или в алгоритм идентификации белков, приводят к снижению достоверности результатов. Указанные недостатки существующих методов протеотипирования обуславливают необходимость совершенствования вычислительных подходов к идентификации ОАП.

Целью работы являлась разработка способа анализа масс-спектрометрических данных для идентификации единичных аминокислотных полиморфизмов, возникающих в результате трансляции несинонимичных нуклеотидных замен в соответствующих генах, и применение разработанного способа для выявления аминокислотных замен в белках человека. Для достижения цели решались следующие задачи:

1. Провести обработку масс-спектров пептидных фрагментов для повышения степени покрытия аминокислотных последовательностей белков идентифицированными пептидами.

2. На модельном наборе масс-спектрометрических данных, обеспечивающих высокую степень покрытия последовательностей, разработать метод выявления одноаминокислотных замен в белках человека.

3. Обобщить метод выявления одноаминокислотных замен в форме универсального алгоритма обработки тандемных масс-спектров; оценить чувствительность и специфичность созданного алгоритма.

4. Применить созданный алгоритм для обработки репозитория масс-спектрометрических данных, определить одноаминокислотные полиморфизмы и охарактеризовать белки человека, содержащие выявленные полиморфизмы.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Термин «протеом» - полная совокупность экспрессируемых в организме белков - был впервые предложен Марком Вилкинсом в связи с обозначившейся необходимостью дополнить знания о геномах соответствующей информацией о кодируемых в них белках . Объектом исследования при анализе протеома может выступать как целый организм, так и клеточный компонент, ткань, субклеточная структура, например, ядро, микросомальная фракция и др. .

Результаты проведения широкомасштабной инвентаризации белков с использованием масс-спектрометрии были опубликованы в работе Шевченко и соавторов в 1996 году . Появление биологической масс-спектрометрии ознаменовало наступление эры высокопроизводительных постгеномных технологий, позволяющих в результате проведения одного эксперимента получить информацию о генах и белках в масштабе всего организма. К постгеномным технологиям, кроме протеомики, относятся также геномика и транскриптомика. При анализе генетического материала постгеномные технологии позволяют устанавливать наличие полиморфизма генов с применением полногеномного ре-секвенирования или высокоплотного картирования однонуклеотидных замен (SNP).

Существующие подходы к исследованию многообразия белков можно разделить на два направления. В первом случае перед постановкой эксперимента заранее задано, идентификацию каких именно белковых молекул планируется провести. При таком подходе идентификацию белков проводят с использованием антител, которые применяют для гистохимического окрашивания тканевых срезов с последующим получением микрофотографий клеток. На микрофотографии среза флуоресцирующие участки соответствуют местам локализации выявляемого белка-антигена, причем интенсивность флуоресценции позволяет получить количественную оценку содержания этого белка.

В рамках крупного международного проекта ProteinAtlas осуществляется масштабная наработка антител к белкам всех генов человека . В ходе выполнения этого проекта было получено и размещено для общественного пользования более 400 000 микрофотографий иммуногистохимических окрашенных срезов практически для всех тканей человека. Сравнительный анализ распределения специфичной окраски белков позволил, в частности, выявить характерные профили экспрессии белков для раковых тканей. Однако, окрашивание тканевых срезов с использованием флуоресцентно-меченных антител является довольно грубым методом исследования протеома. Во-первых, как указывают сами разработчики проекта ProteinAtlas, качество многих коммерчески доступных антител крайне низкое. Примерно половина закупленных антител при верификации показывает низкую специфичность к исследуемому антигену, а также препараты антител часто характеризуются низкой чистотой. Во-вторых, большое количество комплексов антиген-антитело характеризуются константой диссоциации (107-108 М) , что обуславливает ограничение по чувствительности при измерении концентрации белков .

Кроме гистохимического анализа, исследование протеома осуществляется с использованием биологических микрочипов. Белковые микрочипы являются эффективным инструментом трансляционной медицины , но ограниченным по возможностям использования для широкомасштабного исследования протеома. Применение микрочиповых технологий в протеомике редко позволяет проводить идентификацию более десяти белков единовременно: при увеличении количества анализируемых белков стандартизация условий протекания взаимодействия антиген-антитело затруднена. Так, применение микрочипов приводит к появлению ложно-отрицательных результатов в случае, когда для комплексов антиген-антитело различия констант диссоциации составляют несколько порядков. Кроме того, стабильность антител очень сильно зависит от условий их хранения, поэтому использование белковых микрочипов ограничено временем непосредственно после их изготовления, что не позволяет данному виду анализа получить широкое распространение.

Второе направление исследований протеома связано с постановкой эксперимента в нак называемом «панорамном» (survey) режиме, когда заранее неизвестно, какие белки могут быть идентифицированы. Потенциально, в результате панорамного эксперимента могут быть идентифицированы любые белки, закодированные в геноме исследуемого организма, включая даже продукты считающихся не кодирующими участков генома. Технические и методические средства для полногеномного исследования протеома обеспечиваются биологической масс-спектрометрией.

Заключение диссертации по теме «Математическая биология, биоинформатика», Чернобровкин, Алексей Леонидович

1. Проведено протеомное картирование масс-спектрометрических данных, включающее идентификацию белков методом отпечатка пептидных масс с последующим анализом, направленным на выявление белок-специфичных протеотипических пептидов. На примере белков надсемейства цитохромов Р450 показано, что за счет картирования зон локализации белков в геле степень покрытия последовательности идентифицированными пептидными фрагментами увеличивается на 27 %.

2. Идентифицированы протеолитические пептиды, специфичные для форм цитохромов Р450 CYP3A4 и CYP3A5, идентичность последовательностей которых составляет 82%. Выявлены аллельные варианты трансляции цитохромов CYP3A4 и CYP3A5, содержащие одноаминокислотные полиморфизмы M445N (ЗА4), К96Е (ЗА4), L82R (ЗА5) и D277E (ЗА5).

3. Разработан итеративный алгоритм, предназначенный для идентификации одноаминокислотных полиморфизмов белков по тандемным масс-спектрам протеолитических пептидов. При тестировании на контрольном наборе «Aurum Dataset» алгоритм выявления полиморфизмов показал специфичность более 95%. Чувствительность алгоритма была на уровне 30%, что соответствует средней степени покрытия последовательностей, включенных в контрольный набор.

4. В результате анализа масс-спектрометрических экспериментов, депонированных в репозитории PRIDE, выявлено в общей сложности 270 одноаминокислотных полиморфизмов в 156 белках человека, в том числе 51 ОАП (45 белков) ассоциированы с заболеваниями, включая нарушения в системе свертываемости крови и системные амилоидозы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Чернобровкин, Алексей Леонидович, 2012 год

1. Арчаков А.И. и др. Способ повышения точности определения последовательности аминокислотных остатков биополимера на основе данных массспектрометрического анализа, вычислительная система //2010.

2. Арчаков А.И. и др. Цитохромы Р450, лекарственная болезнь и персонифицированная медицина. Часть 1 // Клиническая медицина. 2008. Т. 86. № 2. С. 4-8.

3. Клюев H.A., Бродский Е.С. Современные методы масс-спектрометрического анализа органических соединений // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). 2002. Т. XLVI. № 4. С. 57-63.

4. Лисица A.B. и др. Одномерное протеомное картирование цитохромов Р450 печени человека // Биохимия. 2009. Т. 74. № 2. С. 153-161.

5. Мясоедова К.Н. Новое в изучении цитохромов Р450 // Биохимия. 2008. Т. 73. №9. С. 1199-1205.

6. Петушкова H.A. и др. Идентификация цитохромов Р450 микросом клеток печени человека с помощью масс-спектрометрии // Биомедицинская химия. 2007. Т. 53. №4. С. 400-11.

7. Пономаренко Е.А., Ильгисонис Е.В., Лисица A.B. Технологии знаний в протеомике // Биоорганическая химия. 2011. Т. 37. № 2. С. 190-198.

8. Пономаренко Е.А. и др. Выявление дифференциально-экспрессирующихся белков с испольованием автоматического мета-анализа протеомных публикаций // Биомедицинская химия. 2009. Т. 3. № 1. С. 10-16.

9. Савельева М. и др. Значение генетического полиморфизма изоферментов цитохрома Р450 для персонализированного выбора и режимов дозирования антидепрессантов и антипсихотиков // Клиническая медицина. 2008. Т. 86. № 11. С. 22-28.

10. A gene-centric human proteome project: HUPO~the Human Proteome organization. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2010. Т. 9. № 2. С. 4279.

11. Aebersold R., Mann M. Mass spectrometry-based proteomics. // Nature. 2003. T. 422. № 6928. C. 198-207.

12. Ahrne E., Mtiller M., Lisacek F. Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS // Proteomics. 2010. T. 10. № 4. C. 671-686.

13. Akiyama M. h «p. Ichthyosis bullosa of Siemens: its correct diagnosis facilitated by molecular genetic testing. // The British journal of dermatology. 2005. T. 152. №6. C. 1353-6.

14. Alves G. h jxp. Calibrating E-values for MS2 database search methods. // Biology direct. 2007. T. 2. № 1. C. 26.

15. Alves G., Ogurtsov A.Y., Yu Y.-K. RAId DbS: mass-spectrometry based peptide identification web server with knowledge integration. // BMC genomics. 2008. T. 9. C. 505.

16. Archakov A. h zip. Biospecific irreversible fishing coupled with atomic force microscopy for detection of extremely low-abundant proteins. // Proteomics. 2009. T. 9. № 5. C. 1326-43.

17. Archakov A. h ap. Gene-centric view on the human proteome project: the example of the Russian roadmap for chromosome 18. // Proteomics. 2011. T. 11. № 10. C. 1853-6.

18. Archakov A.I. h zip. AFM fishing nanotechnology is the way to reverse the Avogadro number in proteomics. // Proteomics. 2007. T. 7. № 1. C. 4-9.

19. Archakov A.I., Bachmanova G.I. Cytochrome P-450 and active oxygen. London: Taylor & Francis, 1990.

20. Asara J.M. h ^p. A label-free quantification method by MS/MS TIC compared to SILAC and spectral counting in a proteomics screen. // Proteomics. 2008. T. 8. № 5. C. 994-9.

21. Bairoch A., Apweiler R. The SWISS-PROT protein sequence database and its supplement TrEMBL in 2000. // Nucleic acids research. 2000. T. 28. № 1. C. 45-8.

22. Baldwin M. a. Protein identification by mass spectrometry: issues to be considered. //Molecular & cellular proteomics: MCP. 2004. T. 3. № 1. C. 1-9.

23. Bantscheff M. h ap. Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors. // Nature biotechnology. 2007a. T. 25. № 9. C. 1035-44.

24. Bantscheff M. h ,qp. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. //Analytical and bioanalytical chemistry. 2007b. T. 389. № 4. C. 1017-31.

25. Barsnes H. h ap. PRIDE Converter: making proteomics data-sharing easy. // Nature biotechnology. 2009. T. 27. № 7. C. 598-9.

26. Baumgardner L.A. h Fast parallel tandem mass spectral library searching using GPU hardware acceleration. // Journal of proteome research. 2011. T. 10. № 6. C. 2882-8.

27. Beck F. h ap. The good, the bad, the ugly: Validating the mass spectrometric analysis of modified peptides // PROTEOMICS. 2011. C. n/a-n/a.

28. Bell A.W. h /jp. The protein microscope: incorporating mass spectrometry into cell biology. //Nature methods. 2007. T. 4. № 10. C. 783-4.

29. Binz P.-A. h ,qp. A Molecular Scanner To Automate Proteomic Research and To Display Proteome Images // Analytical Chemistry. 1999. T. 71. № 21. C. 49814988.

30. Binz P.-A. h pp. The molecular scanner: concept and developments. // Current opinion in biotechnology. 2004. T. 15. № 1. C. 17-23.

31. Birney E. h ap. An overview of Ensembl. // Genome research. 2004. T. 14. № 5. C. 925-8.

32. Birney E., Clamp M., Hubbard T. Databases and tools for browsing genomes. // Annual review of genomics and human genetics. 2002. T. 3. C. 293-310.

33. Bochet P. h flp. Fragmentation-free LC-MS can identify hundreds of proteins // PROTEOMICS. 2010. T. 11. № 1. C. n/a-n/a.

34. Boguski M.S., Lowe T.M., Tolstoshev C.M. dbEST-database for "expressed sequence tags". // Nature genetics. 1993. T. 4. № 4. C. 332-3.

35. Borges C.R. h np. Full-length characterization of proteins in human populations. // Clinical chemistry. 2010. T. 56. № 2. C. 202-11.

36. Bromberg Y., Rost B. SNAP: predict effect of non-synonymous polymorphisms on function. //Nucleic acids research. 2007. T. 35. № 11. C. 3823-35.

37. Brosch M. h np. Comparison of Mascot and XITandem performance for low and high accuracy mass spectrometry and the development of an adjusted Mascot threshold. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2008. T. 7. № 5. C. 962-70.

38. Bunger M.K. h ^p. Detection and validation of non-synonymous coding SNPs from orthogonal analysis of shotgun proteomics data. // Journal of proteome research. 2007. T. 6. № 6. C. 2331-40.

39. Bunkenborg J. h jip. Screening for N-glycosylated proteins by liquid chromatography mass spectrometry. // Proteomics. 2004. T. 4. № 2. C. 454-65.

40. Butenas S., Mann K.G., Butenas B. Blood Coagulation. : MAIK Nauka/Interperiodica distributed exclusively by Springer Science+Business Media LLC., 2002.

41. Canas B. h jyp. Mass spectrometry technologies for proteomics. // Briefings in functional genomics & proteomics. 2006. T. 4. № 4. C. 295-320.

42. Care M.A. h Deleterious SNP prediction: be mindful of your training data! // Bioinformatics (Oxford, England). 2007. T. 23. № 6. C. 664-72.

43. Casado-Vela J. h flp. Lights and shadows of proteomic technologies for the study of protein species including isoforms, splicing variants and protein post-translational modifications. // Proteomics. 2011. T. 11. № 4. C. 590-603.

44. Chapman P.F. h ap. Genes, models and Alzheimer"s disease // Trends in Genetics. 2001. T. 17. № 5. C. 254-261.

45. Chen M. h ap. Annotation of Non-Synonymous Single Polymorphisms in Human Liver Proteome by Mass Spectrometry // Protein and Peptide Letters. 2010. T. 17. № 3. C. 277-286.

46. Chen R. h zip. Glycoproteomics analysis of human liver tissue by combination of multiple enzyme digestion and hydrazide chemistry. // Journal of proteome research. 2009. T. 8. № 2. C. 651-61.

47. Choudhary J.S. h Interrogating the human genome using uninterpreted mass spectrometry data. // Proteomics. 2001a. T. 1. № 5. C. 651-67.

48. Choudhary J.S. h «p. Matching peptide mass spectra to EST and genomic DNA databases. // Trends in biotechnology. 2001b. T. 19. № 10 Suppl. C. S17-22.

49. Choudhury V. h ap. Two novel antithrombin variants (L99V and Q118P) which alter the heparin binding // Nouvelle Revue Française. 1994. T. 36. C. 268.

50. Colinge J., Bennett K.L. Introduction to computational proteomics. // PLoS computational biology. 2007. T. 3. № 7. C. el 14.

51. Cooksey A.M. h ap. Identifying blood biomarkers and physiological processes that distinguish humans with superior performance under psychological stress. // PloS one. 2009. T. 4. № 12. C. e8371.

52. Cooper D. The human gene mutation database // Nucleic Acids Research. 1998. T. 26. № l.C. 285-287.

53. Côté R.G. h up. The Ontology Lookup Service: more data and better tools for controlled vocabulary queries. // Nucleic acids research. 2008. T. 36. № Web Server issue. C. W372-6.

54. Cottrell J.S. Protein identification by peptide mass fingerprinting. // Peptide research. 1994. T. 7. № 3. C. 115-24.

55. Craig R., Beavis R.C. TANDEM: matching proteins with tandem mass spectra. // Bioinformatics (Oxford, England). 2004. T. 20. № 9. C. 1466-7.

56. Craig R., Cortens J.P., Beavis R.C. Open source system for analyzing, validating, and storing protein identification data. // Journal of proteome research. 2004. T. 3. № 6. C. 1234-42.

57. Creasy D.M., Cottrell J.S. Error tolerant searching of uninterpreted tandem mass spectrometry data // PROTEOMICS. 2002. T. 2. № 10. C. 1426-1434.

58. Crockett D.K. h ap. Annotated proteome of a human T-cell lymphoma. // Journal of biomolecular techniques: JBT. 2005. T. 16. № 4. C. 341-6.

59. Dai D. h jvp. Identification of Variants of CYP3A4 and Characterization of Their Abilities to Metabolize Testosterone and Chlorpyrifos // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001. T. 299. № 3. C. 825-831.

60. Delahunty C., Yates J.R. Identification of proteins in complex mixtures using liquid chromatography and mass spectrometry. // Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino . et al.. 2003. T. Chapter 5. C. Unit 5.6.

61. Delahunty C.M., Iii J.R.Y. Tech Insight MudPIT: multidimensional protein identification technology Tech Insight // Biotechniques. 2007. T. 43. № 5.

62. Desiere F. h jjp. The PeptideAtlas project. // Nucleic acids research. 2006. T. 34. № Database issue. C. D655-8.

63. Deutsch E. mzML: a single, unifying data format for mass spectrometer output. // Proteomics. 2008. T. 8. № 14. C. 2776-7.

64. Deutsch E.W. The PeptideAtlas Project. // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2010. T. 604. C. 285-96.

65. Deutsch E.W. h ^p. A guided tour of the Trans-Proteomic Pipeline. // Proteomics. 2010. T. 10. №6. C. 1150-9.

66. Deutsch E.W. h ^p. Human Plasma PeptideAtlas. // Proteomics. 2005. T. 5. № 13. C. 3497-500.

67. Deutsch E.W., Lam H., Aebersold R. PeptideAtlas: a resource for target selection for emerging targeted proteomics workflows. // EMBO reports. 2008. T. 9. № 5. C. 429-34.

68. Eckel-Passow J.E. h jsp. An insight into high-resolution mass-spectrometry data. // Biostatistics (Oxford, England). 2009. T. 10. № 3. C. 481-500.

69. Eng J.K., McCormack A.L., Yates III J.R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 1994. T. 5. № 11. C. 976-989.

70. Eriksson J., Fenyo D. Probity: A Protein Identification Algorithm with Accurate Assignment of the Statistical Significance of the Results // Journal of Proteome Research. 2004. T. 3. № 1. C. 32-36.

71. Falkner J. a h up. Validated MALDI-TOF/TOF mass spectra for protein standards. // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2007. T. 18. № 5. C. 850-5.

72. Farrah T. h A high-confidence human plasma proteome reference set with estimated concentrations in PeptideAtlas. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2011.

73. Field D., Wilson G., Gast C. van der. How do we compare hundreds of bacterial genomes? // Current opinion in microbiology. 2006. T. 9. № 5. C. 499-504.

74. Frazer K. a h ap. A second generation human haplotype map of over 3.1 million SNPs. //Nature. 2007. T. 449. № 7164. C. 851-61.

75. Fredman D. h ap. HGVbase: a curated resource describing human DNA variation and phenotype relationships. // Nucleic acids research. 2004. T. 32. № Database issue. C.D516-9.

76. Freed G.L. h ^p. Differential capture of serum proteins for expression profiling and biomarker discovery in pre- and posttreatment head and neck cancer samples. // The Laryngoscope. 2008. T. 118. № 1. C. 61-8.

77. Gabellini N. NTRK2 (Neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2) // Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. 2008. T. 12. № 4. C. 314-317.

78. Galeva N. Direct Identification of Cytochrome P450 Isozymes by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight-Based Proteomic Approach // Drug Metabolism and Disposition. 2003. T. 31. № 4. C. 351-355.

79. Galeva N., Altermann M. Comparison of one-dimensional and two-dimensional gel electrophoresis as a separation tool for proteomic analysis of rat liver microsomes: cytochromes P450 and other membrane proteins. // Proteomics. 2002. T. 2. № 6. C. 713-22.

80. Gao M. h j\p. Large scale depletion of the high-abundance proteins and analysis of middle- and low-abundance proteins in human liver proteome bymultidimensional liquid chromatography. // Proteomics. 2008. T. 8. № 5. C. 93947.

81. Garcia-Blanco M. a, Baraniak A.P., Lasda E.L. Alternative splicing in disease and therapy. // Nature biotechnology. 2004. T. 22. № 5. C. 535-46.

82. Gatlin C.L. h ap. Automated Identification of Amino Acid Sequence Variations in Proteins by HPLC/Microspray Tandem Mass Spectrometry // Analytical Chemistry. 2000. T. 72. № 4. C. 757-763.

83. Gobom J. h £p. A Calibration Method That Simplifies and Improves Accurate Determination of Peptide Molecular Masses by MALDI-TOF MS // Analytical Chemistry. 2002. T. 74. № 15. C. 3915-3923.

84. Griss J. h ap. Published and Perished? the influence of the searched protein database on the long-term storage of proteomics data. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2011. T. 10. № 9. C. Ml 11.008490.

85. Grone J. h ^p. Differential expression of genes encoding tight junction proteins in colorectal cancer: frequent dysregulation of claudin-1, -8 and -12. // International journal of colorectal disease. 2007. T. 22. № 6. C. 651-9.

86. Hamosh A. h £p. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), a knowledgebase of human genes and genetic disorders. // Nucleic acids research. 2005. T. 33. № Database issue. C. D514-7.

87. Hamosh A. h ap. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). // Human mutation. 2000. T. 15. № 1. C. 57-61.

88. Han X., Aslanian A., Yates III J.R. Mass spectrometry for proteomics // Current Opinion in Chemical Biology. 2008. T. 12. № 5. C. 483-490.

89. Hedden P. h ap. Gibberellin Biosynthesis in Plants and Fungi: A Case of Convergent Evolution? // Journal of plant growth regulation. 2001. T. 20. № 4. C. 319-331.

90. Hopfgartner G. h Triple quadrupole linear ion trap mass spectrometer for the analysis of small molecules and macromolecules. // Journal of mass spectrometry: JMS. 2004. T. 39. № 8. C. 845-55.

91. Huang Y. n flp. Statistical characterization of the charge state and residue dependence of low-energy CID peptide dissociation patterns. // Analytical chemistry. 2005. T. 77. № 18. C. 5800-13.

92. Hubbard T. The Ensembl genome database project // Nucleic Acids Research. 2002. T. 30. № 1. C. 38-41.

93. Hustert E. h £p. The genetic determinants of the CYP3A5 polymorphism. // Pharmacogenetics. 2001. T. 11. № 9. c. 773-9.

94. Ilina E.N. h ^p. Direct bacterial profiling by matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry for identification of pathogenic Neisseria. // The Journal of molecular diagnostics: JMD. 2009. T. 11. № 1. C. 7586.

95. Ingelman-Sundberg M. Human drug metabolising cytochrome P450 enzymes: properties and polymorphisms. // Naunyn-Schmiedeberg"s archives of pharmacology. 2004. T. 369. № 1. C. 89-104.

96. International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. // Nature. 2004. T. 431. № 7011. C. 931 -45.

97. Ishihama Y. h pp. Exponentially modified protein abundance index (emPAI) for estimation of absolute protein amount in proteomics by the number of sequenced peptides per protein. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2005. T. 4. № 9. C. 1265-72.

98. Jain R., Wagner M. Kolmogorov-Smirnov scores and intrinsic mass tolerances for peptide mass fingerprinting. // Journal of proteome research. 2010. T. 9. № 2. C. 737-42.

99. Jeffrey L. Cummings. Genotype-proteotype-phenotype relationships in neurodegenerative diseases. : Springer, 2005.

100. Jenkins R.E. h ap. Relative and absolute quantitative expression profiling of cytochromes P450 using isotope-coded affinity tags. // Proteomics. 2006. T. 6. № 6. C. 1934-47.

101. Jones P. h flp. PRIDE: a public repositoiy of protein and peptide identifications for the proteomics community. // Nucleic acids research. 2006. T. 34. № Database issue. C. D659-63.

102. Jones P. h flp. PRIDE: new developments and new datasets. // Nucleic acids research. 2008. T. 36. № Database issue. C. D878-83.

103. Kalmar L. h jip. Mutation screening of the CI inhibitor gene among Hungarian patients with hereditary angioedema. // Human mutation. 2003. T. 22. № 6. C. 498.

104. Keller A. h ap. Empirical Statistical Model To Estimate the Accuracy of Peptide Identifications Made by MS/MS and Database Search // Analytical Chemistry. 2002. T. 74. № 20. C. 5383-5392.

105. Kersey P.J. n jjp. The International Protein Index: an integrated database for proteomics experiments. // Proteomics. 2004. T. 4. № 7. C. 1985-8.

106. Kim S., Gupta N., Pevzner P. a. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases. // Journal of proteome research. 2008. T. 7. № 8. C. 3354-63.

107. Klie S. h £p. Analyzing large-scale proteomics projects with latent semantic indexing. // Journal of proteome research. 2008. T. 7. № 1. C. 182-91.

108. Kremer H. h up. Ichthyosis Bullosa of Siemens Is Caused by Mutations in the Keratin 2e Gene. // Journal of Investigative Dermatology. 1994. T. 103. № 3. C. 286-289.

109. Kuehl P. h ap. Sequence diversity in CYP3A promoters and characterization of the genetic basis of polymorphic CYP3A5 expression. // Nature genetics. 2001. T. 27. №4. C. 383-91.

110. Kuhn R.M. h up. The UCSC Genome Browser Database: update 2009. // Nucleic acids research. 2009. T. 37. № Database issue. C. D755-61.

111. Kuster B. h flp. Mass spectrometry allows direct identification of proteins in large genomes. //Proteomics. 2001. T. 1. № 5. c. 641-50.

112. Lane C.S. h ap. Comparative cytochrome P450 proteomics in the livers of immunodeficient mice using 180 stable isotope labeling. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2007. T. 6. № 6. C. 953-62.

113. Lane C.S. h ,qp. Identification of cytochrome P450 enzymes in human colorectal metastases and the surrounding liver: a proteomic approach. // European journal of cancer (Oxford, England: 1990). 2004. T. 40. № 14. C. 2127-34.

114. Lane E.B., McLean W.H.I. Keratins and skin disorders. // The Journal of pathology. 2004. T. 204. № 4. C. 355-66.

115. Levine a J. P53, the Cellular Gatekeeper for Growth and Division. // Cell. 1997. T. 88. № 3. C. 323-31.

116. Levy S. h AP- The diploid genome sequence of an individual human. // PLoS biology. 2007. T. 5. № 10. C. e254.

117. Lewis D.F.V. 57 varieties: the human cytochromes P450. // Pharmacogenomics. 2004. T. 5. № 3. C. 305-18.

118. Lim A. h ap. Characterization of Transthyretin Variants in Familial Transthyretin Amyloidosis by Mass Spectrometric Peptide Mapping and DNA Sequence Analysis // Analytical Chemistry. 2002. T. 74. № 4. C. 741-751.

119. Lim H. Identification of 2D-gel proteins: A comparison of MALDI/TOF peptide mass mapping to p LC-ESI tandem mass spectrometry // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2003. T. 14. № 9. C. 957-970.

120. Lisitsa A.V. h «p. Application of slicing of one-dimensional gels with subsequent slice-by-slice mass spectrometry for the proteomic profiling of human liver cytochromes P450. // Journal ofproteome research. 2010. T. 9. № 1. C. 95-103.

121. Liu T. h ap. High dynamic range characterization of the trauma patient plasma proteome. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2006. T. 5. № 10. C. 1899913.

122. Liu T. h /ip. Human Plasma N-Glycoproteome Analysis by Immunoaffinity Subtraction, Hydrazide Chemistry, and Mass Spectrometry // Journal of proteome research. 2005. T. 4. № 6. C. 2070-2080.

123. Mallick P. h flp. Computational prediction of proteotypic peptides for quantitative proteomics. //Nature biotechnology. 2007. T. 25. № 1. C. 125-31.

124. Mann M., Jensen O.N. Proteomic analysis of post-translational modifications. // Nature biotechnology. 2003. T. 21. № 3. C. 255-61.

125. Mann M., Wilm M. Error-Tolerant Identification of Peptides in Sequence Databases by Peptide Sequence Tags // Analytical Chemistry. 1994. T. 66. № 24. C. 4390-4399.

126. Marchetti A. h pp. Frequent mutations in the neurotrophic tyrosine receptor kinase gene family in large cell neuroendocrine carcinoma of the lung. // Human mutation. 2008. T. 29. № 5. C. 609-16.

127. Marichal P. h Contribution of mutations in the cytochrome P450 14{alpha}-demethylase (Ergllp, Cyp51p) to azole resistance in Candida albicans // Microbiology. 1999. T. 145. № 10. C. 2701-2713.

128. Martens L. h jxp. PRIDE: the proteomics identifications database. // Proteomics. 2005. T. 5. №13. C. 3537-45.

129. Matthiesen R., Amorim A. Proteomics facing the combinatorial problem. // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2010. T. 593. C. 175-86.

130. McDonald W.H., Yates J.R. Shotgun proteomics: integrating technologies to answer biological questions. // Current opinion in molecular therapeutics. 2003. T. 5. № 3. C. 302-9.

131. Menon R., Omenn G.S. Proteomic characterization of novel alternative splice variant proteins in human epidermal growth factor receptor 2/neu-induced breast cancers. // Cancer research. 2010. T. 70. № 9. C. 3440-9.

132. Menschaert G. h £p. Peptidomics coming of age: a review of contributions from a bioinformatics angle. // Journal of proteome research. 2010. T. 9. № 5. C. 205161.

133. Millar D.S. h Three novel missense mutations in the antithrombin III (AT3) gene causing recurrent venous thrombosis. // Human genetics. 1994. T. 94. № 5. C. 509-12.

134. Mironov A.A. Frequent Alternative Splicing of Human Genes // Genome Research. 1999. T. 9. № 12. C. 1288-1293.

135. Modrek B. Genome-wide detection of alternative splicing in expressed sequences of human genes //Nucleic Acids Research. 2001. T. 29. № 13. C. 2850-2859.

136. Mueller M. h ap. Analysis of the experimental detection of central nervous system-related genes in human brain and cerebrospinal fluid datasets. // Proteomics. 2008. T. 8. № 6. C. 1138-48.

137. Nagaraj S.H., Gasser R.B., Ranganathan S. A hitchhiker"s guide to expressed sequence tag (EST) analysis. // Briefings in bioinformatics. 2007. T. 8. № 1. C. 621.

138. Nedelkov D. Population proteomics: Investigation of protein diversity in human populations // Proteomics. 2008. T. 8. № 4. C. 779-86.

139. Nedelkov D. h ap. High-throughput comprehensive analysis of human plasma proteins: a step toward population proteomics. // Analytical chemistry. 2004. T. 76. № 6. C. 1733-7.

140. Nedelkov D. h ^p. Investigating diversity in human plasma proteins. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2005. T. 102. № 31. C. 10852-7.

141. Nesvizhskii A.I. Protein identification by tandem mass spectrometry and sequence database searching. // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2007. T. 367. C. 87-119.

142. Nesvizhskii A.I., Vitek O., Aebersold R. Analysis and validation of proteomic data generated by tandem mass spectrometry // Nature Methods. 2007. T. 4. № 10. C. 787-797.

143. Ng P.C. h flp. Genetic Variation in an individual human exome // PLoS Genetics. 2008. T. 4. № 8.

144. Ong S.-E., Mann M. Mass spectrometry-based proteomics turns quantitative. // Nature chemical biology. 2005. T. 1. № 5. c. 252-62.

145. Ossipova E., Fenyô D., Eriksson J. Optimizing search conditions for the mass fingerprint-based identification of proteins. // Proteomics. 2006. T. 6. № 7. C. 2079-85.

146. Overbeek R. h ,np. Annotation of bacterial and archaeal genomes: improving accuracy and consistency. // Chemical reviews. 2007. T. 107. № 8. C. 3431-47.

147. Pedrioli P.G.A. Trans-proteomic pipeline: a pipeline for proteomic analysis. // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2010. T. 604. C. 213-38.

148. Perkins D.N. h ^p. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data // Electrophoresis. 1999. T. 20. № 18. C. 3551-3567.

149. Perry D.J., Carrell R.W. Molecular genetics of human antithrombin deficiency. // Human mutation. 1996. T. 7. № 1. C. 7-22.

150. Petrak J. h ap. Déjà vu in proteomics. A hit parade of repeatedly identified differentially expressed proteins. // Proteomics. 2008. T. 8. № 9. C. 1744-9.

151. Pevzner P.A. h /ip. Efficiency of database search for identification of mutated and modified proteins via mass spectrometry. // Genome research. 2001. T. 11. № 2. C. 290-9.

152. Porter C.J., Talbot C.C., Cuticchia A.J. Central mutation databases-a review. // Human mutation. 2000. T. 15. № 1. C. 36-44.

153. Rabilloud T., Hochstrasser D., Simpson R.J. Is a gene-centric human proteome project the best way for proteomics to serve biology? // Proteomics. 2010. C. 1-6.

154. Rappsilber J. h £p. Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome. // Genome research. 2002. T. 12. № 8. C. 1231-45.

155. Redlich G. h zip. Distinction between human cytochrome P450 (CYP) isoforms and identification of new phosphorylation sites by mass spectrometry. // Journal of proteome research. 2008. T. 7. № 11. C. 4678-88.

156. Reid G.E., McLuckey S.A. "Top down" protein characterization via tandem mass spectrometiy. // Journal of mass spectrometry: JMS. 2002. T. 37. № 7. C. 663-75.

157. Rodriguez C. h zip. Proteotyping of human haptoglobin by MALDI-TOF profiling: Phenotype distribution in a population of toxic oil syndrome patients. // Proteomics. 2006. T. 6. C. S272--81.

158. Roher A. h zip. Structural alterations in the peptide backbone of beta-amyloid core protein may account for its deposition and stability in Alzheimer"s disease // J. Biol. Chem. 1993. T. 268. № 5. c. 3072-3083.

159. Rostami-Hodjegan A., Tucker G.T. Simulation and prediction of in vivo drug metabolism in human populations from in vitro data. // Nature reviews. Drug discovery. 2007. T. 6. № 2. C. 140-8.

160. Roth M.J. h zip. "Proteotyping": population proteomics of human leukocytes using top down mass spectrometry. // Analytical chemistry. 2008. T. 80. № 8. C. 285766.

161. Rozman D., Waterman M.R. Lanosterol 14alpha -Demethylase (CYP51) and Spermatogenesis // Drug Metab. Dispos. 1998. T. 26. № 12. C. 1199-1201.

162. Rubina A.Y. h zip. Why 3-D? Gel-based microarrays in proteomics. // Proteomics. 2008. T. 8. №4. C. 817-31.

163. Sadygov R.G., Cociorva D., Iii J.R.Y. Large-scale database searching using tandem mass spectra: Looking up the answer in the back of the book // Nature Methods. 2004. T. 1. № 3. C. 195-202.

164. Sarkozy A. h zip. Germline BRAF mutations in Noonan, LEOPARD, and cardiofaciocutaneous syndromes: molecular diversity and associated phenotypic spectrum. // Human mutation. 2009. T. 30. № 4. C. 695-702.

165. Sattelle D.B., Jones A.K., Buckingham S.D. Insect genomes: challenges and opportunities for neuroscience. // Invertebrate neuroscience: IN. 2007. T. 7. № 3. C. 133-6.

166. Schandorff S. h ,np. A mass spectrometry-friendly database for cSNP identification. //Nature methods. 2007. T. 4. № 6. C. 465-6.

167. Schmuth M. h Ichthyosis update: towards a function-driven model of pathogenesis of the disorders of cornification and the role of corneocyte proteins in these disorders. //Advances in dermatology. 2007. T. 23. C. 231-56.

168. Schweigert F.J., Wirth K., Raila J. Characterization of the microheterogeneity of transthyretin in plasma and urine using SELDI-TOF-MS immunoassay. // Proteome science. 2004. T. 2. № 1. C. 5.

169. Searle B.C., Turner M., Nesvizhskii A.I. Improving sensitivity by probabilistically combining results from multiple MS/MS search methodologies. // Journal of proteome research. 2008. T. 7. № 1. C. 245-53.

170. Seo J., Lee K.-J. Post-translational modifications and their biological functions: proteomic analysis and systematic approaches. // Journal of biochemistry and molecular biology. 2004. T. 37. № 1. C. 35-44.

171. Sherry S.T. dbSNP: the NCBI database of genetic variation // Nucleic Acids Research. 2001. T. 29. № 1. C. 308-311.

172. Shevchenko A. h j\p. Mass Spectrometric Sequencing of Proteins from Silver-Stained Polyacrylamide Gels // Analytical Chemistry. 1996. T. 68. № 5. C. 850858.

173. Shi W.-feng h up. Proteotyping: A new approach studying influenza virus evolution at the protein level // Virologica Sinica. 2008. T. 22. № 5. C. 405-411.

174. Shteynberg D. h np. iProphet: Multi-level integrative analysis of shotgun proteomic data improves peptide and protein identification rates and error estimates. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2011. C. Ml 11.007690-.

175. Smigielski E.M. dbSNP: a database of single nucleotide polymorphisms // Nucleic Acids Research. 2000. T. 28. № 1. C. 352-355.

176. Srebrow A., Kornblihtt A.R. The connection between splicing and cancer. // Journal of cell science. 2006. T. 119. № Pt 13. C. 2635-41.

177. Stamm S. h zip. ASD: a bioinformatics resource on alternative splicing. // Nucleic acids research. 2006. T. 34. № Database issue. C. D46-55.

178. Stein P.E., Carrell R.W. What do dysfunctional serpins tell us about molecular mobility and disease? // Nature Structural Biology. 1995. T. 2. № 2. C. 96-113.

179. Supek F. n zip. Enhanced analytical power of SDS-PAGE using machine learning algorithms. //Proteomics. 2008. T. 8. № 1. C. 28-31.

180. Taylor C.F. Minimum reporting requirements for proteomics: a MIAPE primer. // Proteomics. 2006. T. 6 Suppl 2. C. 39-44.

181. Taylor C.F. h zip. The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE). // Nature biotechnology. 2007. T. 25. № 8. C. 887-93.

182. Thiede B. h zip. Peptide mass fingerprinting. // Methods (San Diego, Calif.). 2005. T. 35. № 3. C. 237-47.

183. Tsvetkov P.O. h zip. Isomerization of the Asp7 residue results in zinc-induced oligomerization of Alzheimer"s disease amyloid beta(l-16) peptide. // Chembiochem: a European journal of chemical biology. 2008. T. 9. № 10. C. 1564-7.

184. Uhlen M. h zip. A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2005. T. 4. № 12. C. 1920-32.

185. Ullrich A. h zip. CANCER-RELATED PROTEIN KINASES // US Patent App. 12/. 2007.

186. Venter J.C. h zip. The sequence of the human genome. // Science (New York, N.Y.). 2001. T. 291. № 5507. C. 1304-51.

187. Vizcaino J.A., Foster J.M., Martens L. Proteomics data repositories: Providing a safe haven for your data and acting as a springboard for further research // Journal of Proteomics. 2010. C. 1-11.

188. W Vogel K. h zip. Developing assays for kinase drug discovery where have the advances come from? // 2007.

189. Westlind-Johnsson A. Comparative analysis of CYP3A expression in human liver suggests only a minor role for CYP3A5 in drug metabolism // Drug Metabolism and Disposition. 2003. T. 31. № >6. C. 755-761.

190. Wheeler D.L. h zip. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. //Nucleic acids research. 2007. T. 35. № Database issue. C. D5-12.

191. Whibley C., Pharoah P.D.P., Hollstein M. p53 polymorphisms: cancer implications. //Nature reviews. Cancer. 2009. T. 9. № 2. C. 95-107.

192. Wilkins M.R. h /ip. From Proteins to Proteomes: Large Scale Protein Identification by Two-Dimensional Electrophoresis and Amino Acid Analysis // Bio/Technology. 1996. T. 14. № 1. C. 61-65.

193. Wu C.H. h ap. The Universal Protein Resource (UniProt): an expanding universe of protein information. // Nucleic acids research. 2006. T. 34. № Database issue. C. D187-91.

194. Yates J R., Eng J.K., McCormack A.L. Mining Genomes: Correlating Tandem Mass Spectra of Modified and Unmodified Peptides to Sequences in Nucleotide Databases // Analytical Chemistry. 1995. T. 67. № 18. C. 3202-3210.

195. Yip Y.L. h Annotating single amino acid polymorphisms in the UniProt/Swiss-Prot knowledgebase. // Human mutation. 2008. T. 29. № 3. C. 3616.

196. Zanger U.M. h ap. Polymorphic CYP2B6: molecular mechanisms and emerging clinical significance. //Pharmacogenomics. 2007. T. 8. № 7. C. 743-59.

197. Zgoda V.G. h £p. Proteomics of mouse liver microsomes: performance of different protein separation workflows for LC-MS/MS. // Proteomics. 2009. T. 9. № 16. C. 4102-5.

198. Zhou H. h ap. Quantitative proteome analysis by solid-phase isotope tagging and mass spectrometry. //Nature biotechnology. 2002. T. 20. № 5. C. 512-5.

199. Zubarev R.A., Zubarev A.R., Savitski M.M. Electron capture/transfer versus collisionally activated/induced dissociations: solo or duet? // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2008. T. 19. № 6. C. 753-61.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.

Заголовок

2
2

Выделение и очистка белков осуществляется поэтапно.

1. Гомогенизация – это тщательное измельчение объектов биохимического исследования до однородного, то есть гомогенного состояния, то есть белки подвергаются тщательной дезинтеграции вплоть до разрушения клеточной стенки.
При этом используют:
а) ножевые гомогенизаторы типа Уорринга;
б) пестиковые гомогенизаторы Поттера - Эльвегейма;
в) шаровые и валковые мельницы – для более плотных объектов;
г) метод попеременного замораживания и оттаивания, при этом разрыв клеточной стенки происходит под действием кристалликов льда;
д) метод «азотной бомбы» – под высоким давлением клетки насыщаются азотом, затем давление резко сбрасывают, выделяется газообразный азот, который как бы взрывает клетку изнутри;
е) УЗ, различные пресс - методы, переваривание клеточных стенок ферментами. В большинстве случаев при гомогенизации выделяется тепло, при этом многие белки могут инактивироваться, поэтому все процедуры проводятся в холодных помещениях при t 0 или охлаждают сырье с помощью льда. При этом тщательно контролируют объем и время разрушения клеток, рабочее давление. Идеальным считается такой гомогенизат, который может подвергнуться дальнейшему экстрагированию.

2. Экстракция белков , то есть их перевод в растворенное состояние; чаще всего экстракцию проводят вместе с измельчением одновременно.

Экстракцию проводят:
а) растворением в 8-10% растворах солей;
б) с использованием буферных растворов с рН от кислых до слабощелочных (боратных, фосфатных, цитратных, трис - буферных: смесь трисаминометана с NH2 – CH3 + HCl;
в) осаждение белков органическими растворителями (этанол, метанол, бутанол, ацетон и их комбинациями), при этом происходит расщепление белково-липидных и белково-белковых компонентов, то есть разрушение ЧСБ.

3. Очистка и фракционирование белков. После экстрагирования производят разделение или фракционирование смеси на индивидуальные белки и их дальнейшую очистку:

а) высаливание – это процесс осаждения белков нейтральными солевыми растворами щелочных и щелочноземельных металлов.

Механизм высаливания – добавляемые анионы и катионы разрушают гидратную белковую оболочку белков, являющуюся одним из факторов устойчивости белковых растворов. Чаще всего применяются растворы сульфатов Na и аммония. Многие белки отличаются по размеру гидратной оболочки и величине заряда. Для каждого белка есть своя зона высаливания. После удаления высаливающего агента белок сохраняет свою биологическую активность и физико-химические свойства. В клинической практике применяется метод высаливания для разделения глобулинов (при добавлении 50% раствора сульфата аммония (NH 4)2SO 4 выпадает осадок) и альбуминов (при добавлении 100% раствора сульфата аммония (NH 4)2SO 4 выпадает осадок).

На величину высаливания оказывают влияние:
1) природа и концентрация соли;
2) рН-среды;
3) температура.

Главную роль при этом играют валентности ионов. Поэтому действие соли оценивают по ионной силе раствора μ:

, то есть ионная сила раствора (μ) равна произведению ½ концентрации каждого иона (С) на квадрат его валентности (V).

Метод Кона является разновидностью высаливания. Одновременно происходит экстракция и осаждения компонентов. Изменяя последовательно температуру (обычно низкие t o –0+8 o С), рН раствора и концентрированного этанола, из плазмы крови последовательно выделяют до 18 фракций белков.

Метод Кона применяют в фармацевтическом производстве при получении кровезаменителей;
б) методы хроматографии . Основоположником разработки хроматографических методов анализа считается русский ученый Михаил Цвет (1903). В настоящее время существует много ее разновидностей. В основе метода лежит способность веществ специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонку или помещенном на каком-либо носителе. При этом происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают соответствующие элюенты (растворители), которые ослабляют силы адсорбции и вымывают адсорбированные вещества из колонки. Вещества собираются в коллекторе фракций.

Основополагающим в хроматографии является коэффициент распределения , который равен отношению концентрации вещества в подвижной фазе к концентрации вещества в неподвижной фазе (или стационарной фазе ).

Неподвижная стационарная фаза – может быть твердой или жидкой или смесью твердой и жидкой.

Подвижная фаза – жидкая или газообразная, она течет по стационарной, или пропускается через нее.

В зависимости от вида стационарной и подвижной фазы бывают различные модификации хроматографического анализа.

Адсорбционная – основана на различной степени адсорбции белков адсорбентом и растворимости их в соответствующем растворителе.

Применяемые адсорбенты – кремниевая кислота, Al 2 О 3 , CaCO 3 , MgO, древесный уголь. Адсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще с буферным раствором) упаковывают в колонке (стеклянная вертикальная трубка). Образец наносят на колонку, затем через нее пропускают растворитель или смесь растворителей.

Разделение основано на том, что вещества с более высоким К распр. (Б), продвигаются по колонке с большей скоростью. Сбор фракций осуществляется с помощью коллектора фракций.

Распределительная хроматография – основана на распределении смеси белков между двумя жидкими фазами. Разделение может происходить на специальной хроматографической бумаге, а также в колонках, как в адсорбционной. Твердая фаза в данном случае служит только опорой для жидкой стационарной фазы. Хроматографическая бумага обладает свойством задерживать воду между своими целлюлозными волокнами. Эта вода - неподвижная стационарная фаза. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движется неводный растворитель (подвижная фаза), молекулы вещества, нанесенного на бумагу, распределяются между двумя фазами в соответствии с их коэффициентом распределения. Чем выше растворимость вещества в подвижной фазе, тем дальше оно продвинется по бумаге вместе с растворителем.
В случае распределения хроматографии на колонке – носители – это целлюлоза, крахмал, силикагель и др., неподвижная фаза – вода. При нанесении на колонку вещества смеси движутся по колонке с разной скоростью с учетом Краспр.

Rf для каждого соединения в стандартных условиях величина постоянная.
Ионообменная хроматография – основана на притяжении противоположно заряженных частиц. Для этого используют различные ионообменные смолы: катионообменные – содержат отрицательно заряженные группы – сульфированные стиролы и КМЦ, которые притягивают положительно заряженные ионы исследуемых веществ. Их называют также кислотными ионообменниками.
Анионообменные смолы, или основные ионообменники, содержат положительно заряженные группы, притягивающие отрицательно заряженные молекулы белков
Триметиламиностирол, это производное стиролов и целлюлозы.
В зависимости от q разделяемых белков используют соответствующие ионообменники, с которыми взаимодействуют определенные белки, а другие беспрепятственно выходят из колонки. «Осажденные» на колонке белки снимают, используя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента.
Аффинная хроматография (или хроматография по сродству) основана на принципе избирательного взаимодействия белков или других макромолекул с иммобилизованными на носителях специфическими веществами – лигандами (это может быть кофермент, если выделяют фермент, антитело антиген и др. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованным лигандам к нему присоединяется только один белок из смеси. Смывается буферными смесями с измененным рН или измененной ионной силой.
Достоинство – возможность одноэтапно выделить заданное вещество высокой степени чистоты.
Метод гель - фильтрации или метод молекулярных «сит» - это разновидность проникающей хроматографии.
Разделение молекул по размерам и форме основано на свойствах молекулярного сита, которые обладают многие пористые материалы, например органические полимеры с трехмерной сетчатой структурой, придающей им свойства гелей. Гель фильтрация – это разделение веществ с помощью гелей, основанное на различиях в размере молекул (сефароза, сефадекс, сефакрил, биогели и т.д.). Под действием эпихлоргидрина полисахаридные цепочки декстрана (синтезируется микроорганизмами) сшиваются в сетчатую структуру, становятся нерастворимыми в воде, но сохраняют к ней большое сродство. Благодаря этой гидрофильности полученные зерна (называемые сефадексом) сильно набухают с образованием геля, которым заполняют колонку. Метод основан на том, что крупные молекулы не проникают во внутреннюю водную фазу, а более мелкие молекулы сперва проникают в поры «сита», как бы застревают в них, а поэтому движутся с меньшей скоростью. Соответственно белки с большей Mr первыми поступают в приемник. В последнее время в проникающей хроматографии все чаще используют в качестве молекулярного сита пористые стеклянные гранулы.
Электрофоретический метод в биохимии – основан на различии скорости передвижения молекул в электрическом поле (аминокислоты, пептиды, белки, нуклеиновые кислоты).
Различие скорости движения зависит:
1. от q молекулы: подвижность молекул тем больше, чем больше суммарный q. Величина q зависит от рН;
2. от размеров молекул: чем крупнее молекулы, тем меньше их подвижность. Это связано с возрастанием сил трения и электростатических взаимодействий крупных молекул с окружающей средой;
3. от формы молекул: молекулы одинакового размера, но различной формы, например, фибрилл и глобул белка обладают различной скоростью. Это связано с различиями в силах трения и электростатического взаимодействия.
Виды электрофореза
а) Изоэлектрическое фокусирование. Разделение происходит на вертикальной колонке в град. как рН, так и напряжения. С помощью специальных носителей амфолитов в колонке устанавливается град. рН от 0 до 14. В колонку помещают смесь веществ, подключаю электроток. Каждый из компонентов движется к той части колонки, где значение рН соответствует его изоэлектрической точке и там останавливается, то есть фокусируется.
Достоинство: происходит разделение, очистка и идентификация белков в один прием. У метода высокая разрешительная способность (0,02 pI).
б) Изотахофорез – это электрофорез на поддерживающих средах. После включения электротока ионы с самой высокой подвижностью движутся к соответствующему электроду первыми, с самой низкой – последними, обладающие промежуточной подвижностью – располагаются посередине.
в) Диск-электрофорез – прибор состоит из двух сосудов с буфером – верхнего и нижнего, соединенных вертикальными трубками, содержащими разнопористый гель. По мере движения ионизированных частиц под действием электротока. Более высокая пористость – в верхней части геля.
г) Иммуноэлектрофорез – метод сочетающий электрофорез с иммунодиффузией (для обнаружения антигенов в сложных физиологических смесях). На специальный носитель перпендикулярно друг другу помещают смесь антигенов и смесь антител. При включении электротока они разделяются на индивидуальные вещества и диффундируют на гелевом носителе. В месте встречи антигена с соответствующим антителом происходит специфическая реакция преципитации в форме дуги. Количеств образовавшихся дуг соответствует количеству антигенов.

Методы определения Mr белков

У большого числа белков химический состав и последовательность аминокислот не установлена (1010–1012 белков), поэтому у таких белков определяют Mr. При этом используются различные методы.
а) Седиментационный метод – определение Mr проводят в специальных центрифугах (первая центрифуга была предложена шведским биохимиком Сведбергом), в которых удается создать центробежное ускорение, которое больше в 200 тыс. и более раз ускорения земного притяжения. Mr определяют по V седиментации молекул. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница белок-растворитель. Скорость седиментации выражают через константу седиментации (S):

где V – скорость перемещения границы белок-растворитель (см/с);
 – угловая скорость ротора (рад/с);
 – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белков (см).
Величина константы седиментации S, которая равна 110–13 С условно принята за 1 и называется 1 Сведбергом (S). S для белков лежит в пределах 1-50 S, иногда до 100 S.
Mr белков определяется по уравнению Сведберга:

где R – универсальная газовая постоянная;
Т – абсолютная температура по Кельвину;
S – константа седиментации;
Д – коэффициент диффузии;
 – плотность растворителя;
V – парциальный удельный объем газа.
Этот метод дорогостоящий из-за применения аппаратуры.
Более просты и дешевы:
б) Гель-фильтрация в тонком слое сефадекса.
Длина пробега белка (в мм) находится в логарифмической зависимости от Mr.
Х – Mr искомого белка на калибровочном графике.
в) Диск-электрофорез в полиакриламидном слое – также существует зависимость между логарифмом Mr калибровочных белков и длиной их пробега.

Методы определения гомогенности белков

Степень чистоты выделенного белка определяется:

ультрацентрифугированием;
методом диск - электрофореза;
различными иммунохимическими методами;
определением растворимости белка (метод Нортропа) основан на правиле фаз, согласно которому растворимость чистого вещества при данных условиях опыта зависит только от температуры, но не зависит от концентрации вещества в твердой фазе.

Если белок гомогенный, то на графике получается один перегиб (а), если есть примеси белков (б, в), то получим несколько перегибов кривой насыщения. У всех белков свои индивидуальные кривые растворимости.

Методы идентификации белков. Методы выделения, очистки, идентификации и изучения мембранных структур. Подготовка к проведению анализа

Предисловие

1 Область применения

2 Нормативные ссылки

3 Термины и определения

4 Сущность метода

5 Средства измерения, вспомогательное оборудование, материалы, посуда и реактивы

6 Отбор проб для анализа

7 Подготовка к проведению анализа

8 Условия проведения анализа

9 Проведение анализа

10 Интерпретация результатов анализа

11 Требования, обеспечивающие безопасность

Приложение А (справочное). Причины отклонения от стандартного хода анализа и способы их устранения

Библиография

Рекомендованный список диссертаций

Посттрансляционная регуляция цитохромов Р450 подсемейства 2В 2013 год, доктор биологических наук Згода, Виктор Гаврилович

Масс-спектрометрическое определение активности и содержания цитохромов P450 2013 год, кандидат биологических наук Москалева, Наталья Евгеньевна

Структурно-функциональное картирование белков цитохром Р450-содержащих монооксигеназных систем 2002 год, доктор биологических наук Колесанова, Екатерина Федоровна

Похожие диссертационные работы по специальности «Математическая биология, биоинформатика», 03.01.09 шифр ВАК

Транскриптомно-протеомный подход для анализа протеоформ клеточной линии HepG2 2018 год, кандидат биологических наук Киселева, Ольга Игоревна

Поиск и идентификация потенциальных биомаркеров рака яичников в сыворотке крови человека 2015 год, кандидат биологических наук Арапиди, Георгий Павлович

Заключение диссертации по теме «Математическая биология, биоинформатика», Чернобровкин, Алексей Леонидович

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Чернобровкин, Алексей Леонидович, 2012 год